注射用益氣復脈（凍干）對膿毒癥誘導小鼠急性肺損傷的改善作用研究?

潘雪薇 薛漓軒 張佳智 代玉潔 李 芳 張媛媛 寇俊萍 △

（1.中國藥科大學，江蘇 南京 211198；2.江蘇省中藥評價與轉化重點實驗室，江蘇 南京211198）

急性肺損傷（ALI）是由膿毒癥、肺炎、創傷、急性胰腺炎等因素引起的臨床危重病，死亡率高達35%～40%，以急性、彌漫性和炎性肺部損傷為特點，主要表現為肺泡毛細血管通透性增加，血管滲漏，引起肺部水腫甚至嚴重的低氧血癥［1］。膿毒癥是感染引起的宿主反應失調所致的致命性器官功能障礙［2］，在膿毒癥引起的多器官功能損傷過程中，最先受到打擊的器官是肺，同時，ALI又是引起膿毒癥患者器官功能衰竭和死亡的獨立危險因素［3］。因此，改善ALI是膿毒癥治療的重要治療方向。近年來中醫藥的發展為膿毒癥急性肺損傷治療提供了新的突破口。中藥在降低炎性指標、清除氧自由基和維持機體平衡方面顯示出一定的優勢，部分清熱解毒、活血化瘀、通里攻下和補益類中藥復方或單味中藥對膿毒癥誘導的急性肺損傷顯示出明顯的改善效果［4］。注射用益氣復脈（凍干）是經典名方“生脈散”經現代化工藝提取和制備的凍干粉針劑，主要用于治療氣陰兩虛型心絞痛與心功能不全［5］。臨床實驗結果表明，膿毒癥患者在早期目標導向治療外靜脈滴注益氣復脈可顯著改善器官組織低灌注和組織缺血，調節氧代謝，降低膿毒癥患者死亡率［6］。此外，前期研究證明益氣復脈（凍干）可以改善血管內皮屏障功能障礙及氣管滴注脂多糖或細顆粒引起的ALI［7-8］，但其是否可以改善膿毒癥誘導的ALI尚不清楚。因此，本研究從肺微血管內皮屏障功能損傷的角度出發，考察了益氣復脈（凍干）對膿毒癥所致小鼠ALI的改善作用，為其臨床用于膿毒癥ALI的防治提供一定實驗基礎和參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性C57BL/6J小鼠18～22 g，共210只，由揚州大學比較醫學中心提供，動物許可證號：SCXK（蘇）2017-0007。所有動物飼養于相對濕度40%～60%，室溫24～26℃，12 h晝夜交替的SPF級動物實驗房中。

1.2 藥物與儀器 注射用益氣復脈（凍干）（天津天士力天之驕藥業有限公司，批號：20170311）；地塞米松（Biosharp生物科技公司，批號：BS134B）；伊文思藍（美國Sigma公司，批號：E2129）；TLR4抗體、VE-cadherin抗體（美國Santa Cruz公司，批號分別為sc-293072、sc-9989）；p120-catenin抗體（美國Abcam公司，批號：ab92514）；P-Src（Y416）抗體、Src抗體（美國CST公司，批號分別為6943S、2108S），髓過氧化物酶（MPO）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A044-1-1）。NanoZoomer 2.0 RS型數碼病理切片掃描儀（日本Hamamatsu公司）；Infinite 200Pro酶標儀（瑞士Tecan公司）；1645050型濕法電轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；冰凍切片機（德國Leica公司）；LSM 700激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.3 分組與給藥 適應性飼養3～5 d后將小鼠隨機分為6組（每組35只）：假手術組、模型組、益氣復脈低劑量組（1 g/kg）、益氣復脈中劑量組（2 g/kg）、益氣復脈高劑量組（4 g/kg）和地塞米松組（5 mg/kg）。各組小鼠于造模前禁食12 h，各給藥組尾靜脈注射相應劑量藥物，假手術組和模型組注射等體積（0.1 mL/10 g）生理鹽水。

1.4 模型制備 各組小鼠藥物干預后1 min立即進行盲腸結扎再穿孔（CLP）造模，腹腔注射4%的水合氯醛麻醉，固定于手術臺上，剃去腹毛。沿小鼠腹白線剪開約1 cm，分離表皮和肌層，在腹腔中鈍性分離盲腸和腸系膜，用5-0縫合線在盲腸全長75%處結扎。用16號針頭在盲腸末端以上由腸系膜側向非腸系膜側貫穿盲腸2次，避開血管，從針孔的兩端擠出少量腸內容物，將盲腸放回腹腔，盡量避免腸內容物黏附在手術切口，逐層縫合關腹，碘酒消毒傷口后，將小鼠放入裝有干凈墊料且可自由飲食的鼠籠中。假手術組只開關腹，不結扎和穿孔盲腸，手術過程中使用恒溫毯維持小鼠肛溫37℃。

1.5 標本采集與檢測 1）HE染色檢測肺組織病理形態學變化。造模后18 h，每組取3只小鼠處死，取左上葉肺組織，4%多聚甲醛固定，經石蠟包埋，切片染色，數字病理切片掃描儀掃描切片。剩余肺組織用于Western blotting及免疫熒光實驗。2）肺組織濕重/干重比測定。每組取8只小鼠，取肺部組織并精確測定質量，記為肺濕重，再將肺組織置于120℃的烘箱中烘干48 h后測定質量，為肺干重，計算肺濕重/干重比以確定肺組織水腫程度。3）肺泡灌洗液（BALF）檢測。每組取8只動物，剝離小鼠氣管，用4號針頭注射器對肺泡進行灌洗，用500 μL磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗3次，回收的BALF（4℃，1 500 r/min離心5 min）離心后棄去上清液，用800 μL PBS重懸沉淀后檢測。4）MPO含量測定。每組取8只小鼠，采集血漿、肺泡灌洗液及肺組織勻漿，嚴格按照MPO試劑盒測定說明書進行實驗操作。5）伊文思藍（EB）檢測肺微血管通透性。每組取8只動物，造模16 h后，尾靜脈注射EB溶液（50 mg/kg），2 h后麻醉小鼠，用生理鹽水從小鼠心臟處灌注，取肺、拍照、吸干多余水分、稱重。每100 mg肺組織加入1 mL甲酰胺進行勻漿，60℃孵育18 h，5 000g離心30 min后取上清，于620 nm波長下測定，按標曲計算EB滲漏量。6）Western blotting法檢測肺組織中蛋白表達。造模18 h后提取肺組織蛋白，定量后采用SDS-PAGE凝膠電泳，200 mA濕法轉膜，用5% BSA封閉2 h，4℃孵育一抗過夜，室溫孵育二抗1.5 h后使用增強型化學發光液顯影，通過凝膠成像儀拍照，分析蛋白表達水平。7）免疫熒光法檢測肺組織切片相關蛋白表達。取肺組織于4%多聚甲醛中固定24 h，40%蔗糖溶液脫水至組織沉底。將脫水后的組織用OCT膠固定在包埋盒中，去除氣泡后，于冰凍切片機內速凍并切片（厚8 μm），吸附于黏附載玻片上。將肺組織切片用PBS浸洗3次，每次5 min，封閉液（5% BSA、0.2% Triton X-100的PBS）室溫封閉1 h，4℃孵育一抗過夜。PBS浸洗后室溫孵育二抗1.5 h，PBS浸洗后用DAPI染色5 min，PBS浸洗后滴加少量抗熒光猝滅封片液，蓋玻片封片，激光共聚焦觀察拍照。

2 結 果

2.1 各組膿毒癥誘導的ALI小鼠肺組織病理形態觀察 結果顯示，與假手術組比較，模型組小鼠肺泡坍塌，肺泡壁充血并伴有炎性細胞浸潤，肺部血管水腫，氣管周圍有輕度炎癥，而益氣復脈和地塞米松能不同程度地改善小鼠肺組織病理學損傷。見圖1。

圖1 各組膿毒癥誘導的ALI小鼠肺組織病理形態（HE染色，100倍）

2.2 各組膿毒癥誘導的ALI小鼠肺水腫情況比較見表1。相比于假手術組，模型組小鼠肺組織濕干重比顯著升高（P<0.01），提示肺部水腫嚴重，低、中、高劑量益氣復脈組小鼠的肺濕干重比均較模型組有所降低。經統計，與模型組相比，益氣復脈低、中劑量組可以顯著降低膿毒癥引起的小鼠肺部水腫（P<0.05或P<0.01），其中益氣復脈中劑量組改善作用最顯著。

表1 各組膿毒癥誘導的ALI小鼠肺水腫情況比較（±s）

表1 各組膿毒癥誘導的ALI小鼠肺水腫情況比較（±s）

注：與模型組比較，?P<0.05，??P<0.01；與益氣復脈低劑量組比較，$P<0.05，$$P<0.01；與益氣復脈中劑量組比較，&P<0.05，&&P<0.01；與地塞米松組比較，△P<0.05，△△P<0.01。下同。

組別假手術組模型組益氣復脈低劑量組益氣復脈中劑量組益氣復脈高劑量組地塞米松組n 8 8 8 8 8 8肺濕重/干重比4.79±0.21**5.59±0.14 5.23±0.29*&△△4.87±0.14**$△△5.29±0.17&&△5.67±0.34$$&&EB滲漏量（μg/g）33.50±4.80**77.87±8.44 35.21±5.72**31.91±2.43**39.47±7.41**51.33±8.78**

2.3 各組膿毒癥誘導的ALI小鼠BALF中細胞數目比較 見表2。與假手術組相比，模型組小鼠BALF中白細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數目均顯著增加（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，益氣復脈中、高劑量組和地塞米松組BALF中白細胞數目顯著降低（P<0.01），其中益氣復脈中劑量組可以顯著抑制肺微血管中白細胞、中性粒細胞和淋巴細胞滲漏到肺泡腔（P<0.05）。

表2 各組膿毒癥誘導的ALI小鼠BALF中細胞數目比較（×104個±s）

表2 各組膿毒癥誘導的ALI小鼠BALF中細胞數目比較（×104個±s）

組別假手術組模型組益氣復脈低劑量組益氣復脈中劑量組益氣復脈高劑量組地塞米松組n888888白細胞數0.18±0.05**0.81±0.46 0.49±0.18 0.29±0.14**0.35±0.07**0.35±0.14**中性粒細胞數0.03±0.02*0.16±0.16 0.12±0.06 0.04±0.02*0.11±0.02 0.07±0.03淋巴細胞數0.05±0.02**0.34±0.24 0.23±0.09 0.08±0.02*0.14±0.05 0.18±0.12

2.4 各組膿毒癥誘導的ALI小鼠肺組織勻漿、BALF和血漿中MPO活力的比較 見表3。相比于假手術組，模型組小鼠肺組織勻漿、BALF和血漿中MPO活力均顯著增強（P<0.01），益氣復脈低、中劑量組和地塞米松組均可顯著抑制膿毒癥誘導ALI小鼠肺組織、BALF和血漿中MPO活力的增加（P<0.05或P<0.01），益氣復脈高劑量組可顯著降低膿毒癥誘導ALI小鼠BALF和血漿中MPO的活力（P<0.01）。

表3 各組膿毒癥誘導的ALI小鼠肺組織勻漿、BALF和血漿中MPO活力的比較（±s）

表3 各組膿毒癥誘導的ALI小鼠肺組織勻漿、BALF和血漿中MPO活力的比較（±s）

組別假手術組模型組益氣復脈低劑量組益氣復脈中劑量組益氣復脈高劑量組地塞米松組n 8 8 8 8 8 8肺中MPO（U/g）0.41±0.16**1.28±0.16 1.03±0.24**&△△0.86±0.17**$△△1.11±0.15&&△△0.64±0.11**$$&&△△BALF中MPO（U/L）42.27±2.73**94.41±9.00 62.70±12.44*49.79±4.18**59.00±5.35**53.46±6.33**血漿中MPO（U/L）122.74±5.74**266.89±22.61 181.79±28.72**△△142.32±9.21**130.50±8.16**94.01±11.57**$$

2.5 各組膿毒癥誘導的ALI小鼠肺組織EB滲漏程度的比較 見圖2，表1。膿毒癥誘導小鼠急性肺損傷后肺組織EB滲漏明顯（P<0.01），益氣復脈各劑量組及地塞米松組均能顯著降低小鼠EB滲漏情況（P<0.01），中劑量組效果最顯著。結果提示益氣復脈可以顯著抑制膿毒癥引起的小鼠肺微血管內皮屏障完整性的破壞，進而改善ALI。

圖2 各組膿毒癥誘導的ALI小鼠肺組織EB滲漏程度

2.6 各組膿毒癥誘導的ALI小鼠肺組織中VE-cadherin和p120-catenin表達比較 見圖3、圖4和表4。上述實驗結果表明，益氣復脈中劑量組改善膿毒癥誘導ALI的效果最佳，后續選取中劑量益氣復脈進一步操作。模型組小鼠肺組織中VE-cadherin和p120-catenin蛋白表達顯著降低（P<0.01），而益氣復脈中劑量組可顯著增加肺組織中VE-cadherin和p120-catenin的蛋白表達（P<0.05或P<0.01）。綜上所述，益氣復脈可能是通過抑制VE-cadherin和p120-catenin表達的下降，恢復黏附連接，改善膿毒癥小鼠肺微血管內皮屏障功能，進而改善ALI。

表4 各組膿毒癥誘導ALI小鼠肺組織中VE-cadherin和p120-catenin表達比較（±s）

表4 各組膿毒癥誘導ALI小鼠肺組織中VE-cadherin和p120-catenin表達比較（±s）

組別假手術組模型組中劑量益氣復脈組n 3 3 3 VE-cadherin/β-actin 1.00±0.11**0.31±0.21 0.82±0.22*p120-catenin/β-actin 1.00±0.10**0.12±0.07 0.94±0.21**

圖3 各組膿毒癥誘導ALI小鼠肺組織中VE-cadherin和p120-catenin表達的影響

圖4 各組膿毒癥誘導ALI小鼠肺組織中VE-cadherin和p120-catenin表達

2.7 各組膿毒癥誘導ALI小鼠肺組織中Src磷酸化和TLR4表達的比較 見圖5，表5。相比于假手術組，模型組小鼠肺組織中Src磷酸化水平和TLR4表達顯著升高（P<0.01），中劑量益氣復脈組可顯著抑制膿毒癥小鼠肺組織中Src磷酸化水平和TLR4表達水平（P<0.05）。

表5 各組膿毒癥誘導ALI小鼠肺組織中Src磷酸化和TLR4表達比較（±s）

表5 各組膿毒癥誘導ALI小鼠肺組織中Src磷酸化和TLR4表達比較（±s）

組別假手術組模型組益氣復脈中劑量組n 3 3 3 p-Src/Src 1.00±0.12**2.62±0.72 1.28±0.37*TLR4/β-actin 1.00±0.20**2.06±0.38 1.12±0.27*

圖5 各組膿毒癥誘導ALI小鼠肺組織中Src磷酸化和TLR4的表達

3 討 論

肺主氣，司呼吸，且肺為嬌臟，易受外邪侵擾，使肺失宣降功能，其通調水道功能也受到影響，膀胱氣化不利，水液運行障礙，導致機體內水液積聚，形成水腫［9］。此外，臨床上膿毒癥患者皮下和體腔也通常會發生水腫，這也與中醫理論“肺與大腸相表里”相符合［10］。膿毒癥合并ALI患者全身內皮通透性的增加，引起的機體水腫會顯著增加患者死亡率［11］。肺泡-毛細血管屏障完整性被破壞引起血管內皮彌漫性損傷，炎性細胞活化是ALI的基本病理特征，也是膿毒癥引起的多器官功能損傷的重要環節［12］。因此，保護膿毒癥中肺臟的功能，是治療膿毒癥合并ALI的重要治療靶標。

益氣復脈來自經典名方生脈散，由紅參、麥冬、五味子3味藥物組成，臨床上常用來治療冠心病心絞痛、慢性心衰等疾病，偶見用于慢性阻塞性肺疾病，改善中晚期肺癌患者生存質量［13］。其中紅參為人參熟制品，味甘、微苦、性微溫，歸脾、肺、心、腎經，具大補元氣、復脈固脫、補脾益肺等功效；麥冬味甘、微苦，性微寒，歸心、肺、胃經，具滋陰生津、潤肺清心之功效；五味子味酸、甘，性溫，歸肺、心、腎經，具收斂固澀、益氣生津、補腎寧心之功效［14］。前期研究顯示，益氣復脈中多種有效成分均可以改善膿毒癥及膿毒癥相關的器官損傷［8］。然而，益氣復脈對于膿毒癥誘導的小鼠肺損傷的影響未見報道。

CLP模型是實驗室復制膿毒癥模型的金標準，是由腹部手術引起的創傷、盲腸結扎導致的組織壞死以及腸道內菌群的泄露引起的腹部感染。該模型操作簡單，可重復性高，廣泛應用于膿毒癥的病理生理研究［15］。在ALI的發生發展過程中，炎癥激活巨噬細胞，并將中性粒細胞招募至毛細血管來殺滅病原體，MPO會隨中性粒細胞浸潤釋放到炎癥部位［16］。此外，毛細血管內皮屏障被破壞導致了中性粒細胞從血管滲漏到肺泡腔，中心粒細胞的遷移和活化是ALI進程中與炎癥反應和肺水腫相關的重要事件［17］。本文結果顯示模型組小鼠肺組織病理形態損傷嚴重、炎性細胞及MPO水平升高、肺水腫及肺微血管內皮通透性顯著增加，而益氣復脈可顯著改善小鼠肺組織病理損傷、減輕肺部炎癥反應、降低肺水腫及內皮通透性，從而改善膿毒癥誘導的小鼠肺損傷。

TLR4是一種Ⅰ型跨膜蛋白，可以識別高度保守病原相關分子，從而啟動先天免疫反應和炎癥［18］。據報道，TLR4信號通路的激活在病毒誘導的炎癥反應和隨后的細胞因子風暴中起著至關重要的作用，從而導致嚴重的ALI，急性呼吸窘迫綜合征，MODS甚至死亡［19］。TLR4的激活可通過促進Src磷酸化，導致VE-cadherin和p120-catenin的酪氨酸磷酸化及降解，增加內皮通透性，引起肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞的彌漫性損傷［20］。本文結果顯示益氣復脈可以通過抑制膿毒癥模型誘導的TLR4的激活和Src的磷酸化，恢復肺血管內皮VE-cadherin和p120-catenin的表達，降低肺血管內皮通透性，進而抑制膿毒癥引起的小鼠肺組織、BALF及血漿中MPO的活化以及炎性細胞浸潤，改善肺病理學損傷及肺水腫，改善膿毒癥誘導的小鼠ALI。

綜上所述，益氣復脈可能是通過調節TLR4/Src/VE-cadherin/p120-catenin信號通路，進而維持小鼠肺血管內皮屏障功能，改善膿毒癥誘導的小鼠肺組織彌漫性損傷，抑制血管中炎癥細胞滲漏到肺泡腔及肺組織中性粒細胞遷移浸潤，進而改善ALI。提示益氣復脈對于臨床治療膿毒癥合并ALI的潛在可能性。但其具體如何調節肺血管內皮屏障功能，對于膿毒癥引起的其他臟器損傷是否具有保護作用有待進一步研究。本研究結果為益氣復脈臨床應用于膿毒癥或細菌、病毒引起的肺部疾病的防治提供了參考依據。