高寒草甸黃帚橐吾種群根際/非根際土壤可培養微生物群落特征

劉旻霞,李博文,孫瑞弟,張婭婭,宋佳穎,張國娟,徐 璐,穆若蘭

西北師范大學地理與環境科學學院, 蘭州 730070

土壤微生物種類繁多,數量龐大,包括原核微生物(細菌、放線菌等)和真核微生物(原生動物、真菌等)兩大類,不僅是土壤養分循環、有機物降解等生物學過程的最主要動力之一,還維持著生態系統的功能完整性[1]。與此同時,其生物多樣性還受到土壤酶活性及理化性質的影響(碳、氮、磷等),土壤微生物的研究也是維持生態系統服務功能的有效手段[2]。根際作為土壤微域結構的主要類型之一,受到植物根系、環境因素及微生物活動的影響,具有較高的生物酶活性,在維持區域生態系統循環等方面有重要作用。因此,有關根際土壤微生物的數量變化及群落分布逐漸成為生態學領域的研究重點。近年來,關于土壤微域結構對微生物群落分布的影響研究較多,植物根際作為土壤微域結構之一,也越來越受到研究者的關注[3-5]。此外,許多學者經過研究后認為環境因素也是影響土壤中微生物群落分布的主要因素之一。王穎等探究了青藏高原高寒草甸不同海拔梯度下土壤微生物碳源利用差異及影響機制,發現其海拔差異主要受到土壤含水量、植被豐富度和年均降水量的影響[6]。單文俊等探討了氮沉降對溫帶天然次生林微生物數量變化的影響[7]。李君劍等以關帝山不同海拔土壤為研究對象,探究了固氮菌和硝化細菌的變化特征及其影響因素[8]。

青藏高原作為世界的第三極,形成了獨具特色的生態環境,其復雜多樣的生態系統也使得土壤微生物種類具有多樣性[9]。隨著全球變暖的影響,青藏高原高寒草甸已經出現生態退化的趨勢,毒雜草入侵現象愈發嚴重[10]。黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)為菊科橐吾屬多年生草本植物,被認為是指示一個地區草地植被退化的重要物種,種群數量越多,表明該地區草地退化現象越嚴重,反之則表明該地區草地退化程度較輕[11]。近年來,旅游業的發展使得青藏高原游客增多,加之過度放牧等現象加劇,進一步加劇了高寒草甸草地退化的現象。與此同時,由于甘南高寒草甸地區土壤氮含量較高,且黃帚橐吾自身具有耐受溫度變化和抗干旱的生物學特性,使其不斷快速擴張繁殖,成為青藏高原高寒草甸的優勢毒草[12]。海拔梯度的改變包含諸多環境因子的變化,這為研究土壤微生物及草地植被對環境的適應性響應提供了良好的條件,尤其是在全球變暖的背景下,海拔常常作為研究植物根際土壤微生物如何應對環境變化的理想場所。然而,目前關于青藏高原東北部海拔梯度上植物根際土壤微生物及功能群變化的研究較為缺乏。基于此,本文擬探究以下科學問題：黃帚橐吾種群根際/非根際土壤微生物群落分布特征隨海拔如何變化？海拔梯度上影響黃帚橐吾種群根際/非根際土壤微生物群落分布特征隨海拔如何變化？其變化特征與毒雜草黃帚橐吾之間有何內在關系？通過以上問題的回答,有助于了解青藏高原高寒草甸土壤微生物對毒雜草入侵的響應機制,更好的為青藏高原生態環境保護及高質量發展提供理論依據及技術支撐,為更好的踐行綠水青山就是金山銀山的生態理念,構筑好青藏高原生態安全屏障。

1 研究地區與研究方法

1.1 研究區概況

研究區位于青藏高原東北部甘南藏族自治州(34°56′N,102°54′E)。氣候類型為高寒濕潤性氣候,年平均氣溫2.1℃,12月到次年2月平均氣溫-8.6℃,6至8月平均氣溫11.4℃,≥0℃的年積溫1732℃,無絕對無霜期。光照充足,雨熱同季,年降水量557.4 mm。地表徑流深200—350 mm,年蒸發量1222 mm。土壤類型為高寒草甸土。研究區樣地如圖1。

圖1 研究區樣地布置示意圖Fig.1 Plot of the study area

1.2 實驗設計與樣品采集

2019年7月在甘南藏族自治州選擇坡向一致(北坡)的山地(通過360°電子羅盤進行坡向定位)于3個海拔梯度(3000、3500、4000 m)隨機選取8個0.5 m×0.5 m的樣方。每個樣方內選取5株長勢較一致的黃帚橐吾,采用抖落法采集植物根際土[13]。非根際土壤取植物根際投影范圍外自地面垂直0—15 cm范圍內的土樣,分別混合均勻后立即裝入自封袋中帶回實驗室,放在-70℃的冰箱中速凍后,再進行冷凍干燥作為凍干土樣。另一部分土壤自然風干后,研磨、過篩,用于土壤理化性質及酶活性的測定。研究區基本情況見表1。

表1 監測樣地概況

1.3 土壤微生物的分離培養

土壤微生物采用稀釋涂布平板法培養,其中細菌使用牛肉膏蛋白胨培養基37℃下倒置培養48 h后計數；真菌使用馬丁氏孟加拉紅培養基28℃下倒置培養3—4 d后計數；放線菌使用改良高氏一號培養基(加入3%的重鉻酸鉀溶液以抑制細菌生長)28℃下倒置培養5—7 d后計數[14]。固氮菌使用改良的Ashby培養基,氨化細菌使用牛肉膏蛋白胨培養基,硝化細菌使用改良斯蒂芬遜培養基,功能菌均采用MPN法進行數量測定[15]。

1.4 土壤理化性質及酶活性的測定

土壤理化性質采用如下方法測定：土壤含水量用烘干法(重復3次), pH值用水浸提電位法,全氮用半微量凱氏定氮法,全磷用硫酸-高氯酸消煮法,有機碳用硫酸消煮-重鉻酸鉀外加熱法,速效氮用堿解擴散法,速效磷用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法。土壤溫度用多功能測溫儀(DT-131)測定,容重采用環刀法測定。土壤脲酶(Urease,URE)活性采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定,過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法測定[16]。

1.5 數據分析與處理

所有數據在Excel 2007中進行統計和計算,運用SPSS 18.0進行相關分析和單因素方差分析,用CANOCO 4.5軟件進行冗余分析(Redundancy analysis,RDA),并在Origin 9.0中作圖；通徑分析計算出決策系數后在GraphPad Prism 8中繪制熱圖。

通徑分析方法將自變量xi(i= 1,2,…,m)與因變量y的簡單相關系數riy,剖分為xi對y的直接效應(即直接通徑系數)和xi通過其他自變量對y的間接效應(即間接通徑系數),從而能直接比較各因素的相對重要性。設因變量y受多個因素x1,x2,…,xm的影響,且每個因素與y的關系是線性的,則可建立多元回歸方程：

y=b0+b1x1+b2x2+…+bmxm

將實際觀測值代入上式,利用最小二乘法原理即可以求得通徑系數[17]。

用決策系數表示各自變量對因變量的綜合決定作用,是通徑分析中的決策指標[18],用以把各自變量對因變量的綜合作用進行排序,最終確定主要決定因子和限定因子。決策系數最大的為主要決定因子,而決策系數為負值且最小的為主要限定因子。

2 結果與分析

2.1 不同海拔梯度根際/非根際土壤微生物類群變化

由表2可得,隨著海拔升高根際土壤中細菌和真菌數量均逐漸增加,但細菌在微生物總數中的占比最高且變化范圍較大,數量差值最大時達到了33.02×107cfu/g；放線菌數量逐漸減小,當海拔達到4000 m時銳減至2.06×107cfu/g；根際土壤微生物總數隨海拔升高表現出先增加后減小的變化趨勢,非根際土壤則逐漸增加。此外,根際土壤細菌、真菌和微生物總數均大于非根際,放線菌數量則在海拔3500 m時表現為非根際數量大于根際。功能群方面,固氮菌、氨化細菌和功能群總數均隨海拔升高而增加,且根際土壤大于非根際；硝化細菌的數量則呈“V型”變化,在海拔3500 m時最小,非根際土壤數量大于根際土壤。

表2 不同海拔梯度土壤微生物及功能群分布特征

2.2 不同海拔梯度根際/非根際土壤理化性質及酶活性的變化

圖2表明,隨著海拔增加,土壤有機碳、速效氮隨海拔增加而增大,但根際土壤有機碳大于非根際,而根際土壤速效氮則遠低于非根際；土壤含水量、全氮和速效磷隨海拔升高表現為先增加后減小的變化,其中,根際土壤含水量大于非根際,根際土壤全氮和速效磷則低于非根際,在3500 m時根際和非根際速效磷差值達到了1.63 mg/kg；根際土壤脲酶與過氧化氫酶活性均大于非根際,且呈“倒V”變化趨勢,在海拔3500 m時,兩種酶活性在根際土壤中分別為0.45 mg/g和0.57 mg/g；土壤pH隨海拔的增加呈現先減小后增大的變化趨勢,土壤溫度、全磷和電導率呈遞減的趨勢,且根際和非根際變化不顯著；土壤容重無明顯變化。

圖2 不同海拔梯度土壤理化性質和酶活性的變化Fig.2 Changes of soil physical and chemical properties and enzyme activities in different altitude gradients

2.3 不同海拔梯度根際/非根際土壤微生物及功能群的冗余分析

RDA分析表明(圖3、4),實線箭頭代表不同微生物類群,虛線箭頭代表各環境因子；虛線與實線之間的夾角代表各環境因子與土壤微生物之間的相關性；其海拔間的差異可用連線的長短來表示。結果可得,根際土壤中,細菌和真菌主要受到速效氮、有機碳和全氮的影響,非根際土壤中細菌則與有機碳和土壤溫度有關,真菌為速效氮和全氮；放線菌在根際和非根際土壤中變化不大,主要受土壤溫度和電導率的影響。微生物功能群中,根際土壤固氮菌和氨化細菌主控因子為速效氮和有機碳,非根際土壤則為有機碳、pH和土壤溫度。硝化細菌在根際土壤中主要受到全磷和全氮的影響,非根際土壤中則為土壤全磷、pH和脲酶。

圖3 根際土壤微生物及功能群與環境因子的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of rhizosphere soil microorganism, functional group and environmental factorsSWC:土壤含水量 Soil water content;SOC:有機碳 Soil organic carbon;STN:全氮 Soil total nitrogen;STP:全磷 Soil total phosphorus;AP:速效磷 Available phosphorus;AN:速效氮 Available nitrogen;ST:土壤溫度 Soil temperature;SC:土壤電導率 Soil conductivity;UW:容重 Soil bulk density;URE:脲酶 Urease;CAT:過氧化氫酶 Catalase

圖4 非根際土壤微生物及功能群與環境因子的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of non-rhizosphere soil microorganism, functional group and environmental factors

2.4 不同海拔梯度根際/非根際土壤微生物、功能群與環境因子的通徑分析

通過RDA分析后篩選出對土壤微生物和功能群影響較大的環境因子：土壤溫度、有機碳、全氮、全磷、速效氮、pH、脲酶和電導率。為探究這8個環境因子對土壤微生物及功能群影響的重要性大小,對其進行通徑分析。結果表明(圖5),在3個海拔梯度上,三大類土壤微生物影響因子各不相同,土壤溫度、全磷和電導率對根際土壤細菌有負效應,其他環境因子均表現為正效應,非根際土壤中溫度和有機碳對細菌的影響較大；根際土壤中真菌決策系數速效氮>有機碳>全氮,非根際土壤則為速效氮>全氮>有機碳,表明不論根際還是非根際土壤,速效氮對真菌正效應作用較大,此外全磷決策系數最小,說明其對真菌限制作用較大；放線菌在根際和非根際土壤中較為相似,土壤電導率和溫度對放線菌生長有促進作用,而有機碳和速效氮則起到了限制作用,但是根際土壤中決策系數均高于非根際土壤,表明土壤電導率、溫度、有機碳和速效氮在根際土壤中對其影響較大。微生物功能群中,固氮菌和氨化細菌較為相似,根際土壤決策系數速效氮>有機碳>全氮,且表現為正效應,而土壤溫度和電導率為主要限制因素,非根際土壤中主要受到土壤溫度和有機碳的影響；根際土壤中硝化細菌全磷決策系數最大,全氮決策系數最小,海拔3500 m上決策系數分別為1.125和-0.626,表明其主要受全磷和全氮的影響,非根際土壤中pH決策系數最大,土壤脲酶決策系數最小,說明非根際土壤硝化細菌主要受pH和脲酶的影響。

3 討論

土壤微生物作為影響地球化學循環的重要因子,不僅對改變土壤理化性質和促進植物生長發育具有重要意義,同時還能夠作為土壤中養分的儲存庫參與土壤中的養分循環,因此是指示土壤發育狀況和養分循環的重要指標[19]。在高寒草甸生態系統中,根際土壤微生物的群落結構對外界資源的變化具有耐受性和靈敏性,能夠準確并迅速反應土壤微域的變化狀況,是衡量土壤健康的重要指標之一[20]。本研究中,隨著海拔不斷升高,細菌和真菌在根際和非根際土壤中數量均不斷增加,且在根際土壤中數量均大于非根際土壤(表2),這可能是因為黃帚橐吾對于環境條件的改變具有一定耐受性,隨著海拔的升高,溫度下降,物種豐富度降低,而黃帚橐吾種群數量則不斷增加。加之其根系發達且集中,表層水分滲透力差,從而導致根際土含水量較高,適宜微生物的生長,因此細菌和真菌數量在根際土壤中高于非根際土[21]。放線菌數量變化往往受到溫度、濕度、海拔以及區域小氣候等因素的影響,植物根系對放線菌數量變化的影響不顯著[22]。本文中,隨著海拔不斷升高,溫度逐漸成為環境的主導性因素,放線菌數量也隨之減小,在根際和非根際土壤中數量差異較小。土壤微生物功能群指執行著同一種功能的相同或不同形態的土壤微生物,與土壤碳、氮循環密切相關。本文中,固氮菌和氨化細菌較為相似,其數量隨著海拔不斷升高而增加,且根際土壤數量大于非根際。這可能是因為黃帚橐吾種群通過促進微生物的銨化速率,使其快速生長以維持自身發育所需的養分,當海拔不斷升高,黃帚橐吾種群數量也遞增,因此固氮菌和氨化細菌數量不斷增加,且根際土壤中數量大于非根際[23]。硝化細菌數量則表現為非根際土壤大于根際土壤,隨海拔升高呈“V型”變化,在海拔3500 m時最少。這可能是因為海拔3500 m上物種豐富度最高,物種數量過多導致不同植物種群之間競爭較為嚴重,因此硝化細菌在此海拔上數量最少。此外,硝化細菌屬自養需氧型細菌,根際土壤含氧量低而不利于硝化細菌生長,使得非根際土壤數量大于根際土壤[24]。

隨著海拔不斷升高,氣溫逐漸降低,降水在一定范圍內增加,使得不同海拔上其生境也各不相同,并對土壤理化性質產生影響[25]。本研究中,隨著海拔逐漸升高,土壤溫度、全磷和電導率呈遞減的趨勢,在根際和非根際土壤中變化不顯著。這是因為海拔4000 m時坡度較大(表1),土壤侵蝕現象較為嚴重,使得土壤全磷含量減少,同時由于人為因素干擾減少,土壤鹽漬化也隨之降低,因此電導率含量隨海拔升高而遞減[26]。土壤有機碳和速效氮則逐漸增加,這是因為降雨量隨著海拔升高而增加,加快了植被生物量的積累,土壤有機碳分解速率加快,因此其含量也逐漸增加[27]。根際土壤速效氮、全氮含量低于非根際土壤,這也與石國璽研究結果一致[28]。根際土壤脲酶與過氧化氫酶活性均大于非根際,且呈“倒V”變化趨勢(圖2),這可能是因為根際土壤對于酶活性生長起促進作用,同時3500 m海拔土壤有機質和全氮含量最高,使得土壤酶活性達到了高峰[29]。

土壤微生物及功能群對環境因子的變化具有敏感性,根際和非根際土壤在微生物數量、酶活性、養分含量上存在明顯的差異。冗余(RDA)分析發現,土壤微生物數量及功能群變化與環境因子的改變密切相關,土壤溫度、有機碳、電導率、pH、全氮、全磷、速效氮及脲酶這8個環境因子是影響根際/非根際土壤微生物及功能群的主要因素(圖3)。決策系數熱圖表明(圖5),土壤溫度、全磷和電導率對根際土壤細菌起負效應,其他環境因子均表現為正效應,非根際土壤中溫度和有機碳對細菌的影響較大。這可能是因為細菌偏好生存在營養豐富、有機物易于分解的土壤中,隨著海拔不斷增加,植物種群對細菌的影響逐漸變小,溫度成為環境的主導性因素,而黃帚橐吾種群根際和非根際土壤細菌數量也受到溫度的影響而產生變化[30]。根際土壤中真菌決策系數速效氮>有機碳>全氮,非根際則為速效氮>全氮>有機碳(圖5)；放線菌在根際和非根際土壤中較為相似,土壤電導率和溫度對放線菌生長有促進作用,而有機碳和速效氮則起到了限制作用。這可能是因為黃帚橐吾種群在物種擴張的過程中,形成了只適合自身生長的微生物群落,而對于土壤中的真菌和放線菌影響較小,因此在根際和非根際土壤中影響真菌和放線菌的環境因子較為相似[31]。微生物功能群中,固氮菌和氨化細菌較為相似,根際土壤決策系數速效氮>有機碳>全氮,且表現為正效應,而土壤溫度和電導率為主要限制因素,非根際土壤中主要受到土壤溫度和有機碳的影響(圖5)。這可能是因為黃帚橐吾種群的生長與土壤氮含量有關,雖然根際土壤中氮含量低于非根際土壤,但是黃帚橐吾對土壤養分的限制有更高的耐受力,氮含量降低并未使其受到顯著影響,因此根際土壤中速效氮對其仍表現為正效應且影響最大[32]。海拔升高使得溫度下降,降水減少,加之有機碳含量遞增,因此非根際土壤中溫度和有機碳是影響其數量變化的主要決策因子。根際土壤中硝化細菌受全磷和全氮的影響,非根際土壤中脲酶決策系數最小,表明非根際土壤硝化細菌主要受脲酶的影響。導致黃帚橐吾種群根際和非根際土壤中硝化細菌的影響因子不同的原因可能是較高的酶活性能夠使底物更好的分解,使得根際土壤中的營養物質具有更高的可利用性,而脲酶活性在非根際土壤中較低,不利于硝化細菌的繁殖,因此是限制其生長的主要因素[33]。

圖5 土壤微生物及功能群與環境因子決策系數熱圖Fig.5 Soil microbial and environmental factors decision coefficient heat map 圖中不同顏色代表決策系數不同,白色表示決策系數為0,藍色代表決策系數為負,粉色代表決策系數為正；由白色向藍色逐漸加深表示決策系數越小,由白色向粉色逐漸加深表示決策系數越大

4 結論

(1)隨著海拔升高,細菌和真菌在根際和非根際土壤中數量均不斷增加,且根際土壤大于非根際；放線菌數量則遞減,在根際和非根際土壤中數量差異較小；固氮菌和氨化細菌數量隨海拔升高遞增,根際土壤數量大于非根際；硝化細菌數量則表現為非根際土壤大于根際土壤,隨海拔升高呈“V型”變化。

(2)細菌在根際和非根際土壤中主要受土壤溫度的影響,真菌則是速效氮,放線菌為有機碳和電導率；固氮菌和氨化細菌在根際土壤中的主導影響因素是速效氮,非根際土壤中為土壤溫度,硝化細菌根際土壤主要受全磷的影響,非根際土壤則受到脲酶的限制。

(3)黃帚橐吾作為高寒草甸的優勢毒草,對于土壤微生物的影響較大。除硝化細菌外,根際土壤微生物數量均高于非根際土壤,表明黃帚橐吾種群對土壤微生物生長起到促進作用。