一種實時熒光定量PCR方法鑒定野鳥中禽流感病毒方法的建立

楊國祥 周豪 朱功良 李勇 蔡華銳 張俊 陳婧 陳光 馮偉 陳全姣

摘 要： 為滿足高通量快速檢測野鳥中禽流感病毒的需要，本研究針對A型流感病毒M基因保守區(qū)域設(shè)計了一對引物和探針，建立了一種能夠檢測A型禽流感病毒的實時熒光定量PCR方法，并對該方法的靈敏性、特異性和穩(wěn)定性進行了評估。結(jié)果顯示，該方法相較于傳統(tǒng)的雞胚分離和RT-PCR方法，具有靈敏度高、特異性好和耗時短等優(yōu)點，可用于檢測野鳥中攜帶的禽流感病毒。

關(guān)鍵詞： 禽流感病毒;野鳥;熒光定量RT-PCR

中圖分類號：S851.3文獻標識碼：A文章編號：1004-3020（2021）03-0035-05

野生鳥類作為禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）的天然宿主，在流感病毒的貯存、傳播和變異中發(fā)揮著重要作用。所有亞型AIV均能從野鳥體內(nèi)分離，它們攜帶病毒，但一般不表現(xiàn)出臨床癥狀，并且可以通過遷徙將流感病毒擴散至世界各地。從家禽和哺乳動物體內(nèi)分離到的流感病毒均直接或間接來自野鳥，對家禽養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全造成了嚴重威脅，因此建立科學(xué)快速的診斷方法顯得尤其重要。傳統(tǒng)的流感病毒分離鑒定方法面臨著耗時長等缺點，因此建立一種更加快速、準確、靈敏的方法來檢測野鳥中攜帶的流感病毒，對于流感病毒的監(jiān)測與預(yù)警顯得尤為重要。實時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR，QPCR）技術(shù)以其快速、特異性強、靈敏度高，重復(fù)性好，全封閉反應(yīng)等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于各種病原檢測中。本研究基于A型AIV中高度保守的M基因作為檢測靶點，建立了一種TaqMan探針實時熒光定量PCR方法，用于檢測野鳥糞便樣本中的流感病毒，既可以作為應(yīng)急檢測技術(shù)應(yīng)對突發(fā)疫情，也可以用于對野鳥攜帶的流感病毒進行常規(guī)檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品

本實驗室鑒定保存的兩株禽流感病毒標準株H6N1、H9N2雞胚尿囊液各一份。100份野鳥糞便樣本于2020年1月13日在湖北省黃梅縣龍感湖采集，并于-80℃保存。

雞傳染性囊病病毒（IBDV），禽白血病病毒（ALV）來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)。

1.1.2 試劑

病毒RNA/DNA提取試劑盒（購自西安天隆科技公司）;DNA Marker DL2000（TAKARA）;HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit（Vazyme）;T7 High Yield RNA Transcription Kit（Vazyme）;Endo-Free Plasmid Mini Kit II（Omega）;Gel Extraction Kit（Omega）;MicroElute RNA Clean Up Kit（Omega）。

1.1.3 儀器設(shè)備

熒光定量PCR儀（Bio-RadCFX96）;全自動核酸提取儀（天隆GeneRotex96）;移液器（德國Eppendorf公司）;離心機（ Eppendorf ）;瓊脂糖水平電泳儀（DYCP-3ICN）;PCR儀（TProfessional）;漩渦混合器（VORTEX-2）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計與合成

根據(jù)本實驗室野鳥中分離到的流感病毒毒株序列設(shè)計了多對引物探針，并參考世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO 2014）及中國國家流感中心（Chinese National Influenza Center，CNIC 2011）推薦的多對流感病毒引物和探針序列[7]，通過比較幾組引物和探針之后，從中選擇了一組靈敏度最佳的引物探針。引物、探針均由武漢擎科生物有限公司合成，用無核酶水稀釋至10 umol/L工作濃度，分裝置-20℃保存?zhèn)溆?，引物和探針序列見?。

1.2.2 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化

利用HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit（Vazyme）試劑盒，以A/Chicken/Hunan/8.27 YYGK3W3/2018（簡稱3W3）毒株核酸為模板對PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行優(yōu)化，選取ct值最小的反應(yīng)條件。最終確定反應(yīng)體系如下：2X One step Q probe mix，10 μl;One step Q Probe enzyme mix，1 μl;IAV-F（10 umol/L）和IAV-R（10 umol/L），0.4 μl;IAV-P（10 umol/L），0.2 μl;模板RNA 8 μl，總體系20 μl。反應(yīng)條件如下：50℃逆轉(zhuǎn)錄，15 min;95℃預(yù)變性，30 s;95℃，10 s，60℃，30 s，共擴增45個循環(huán)。

1.2.3 標準曲線的建立及靈敏度評價

根據(jù)3W3毒株M片段基因組序列，在其M基因兩端設(shè)計了一對引物，擴增M基因片段全長后克隆至PHW-2000載體T7啟動子下游形成重組質(zhì)粒，導(dǎo)入TOP10感受態(tài)細胞中進行擴增，使用Endo-Free Plasmid Mini Kit II（Omega）提取質(zhì)粒并測序鑒定，設(shè)計了一段包含T7啟動子序列的引物，擴增包含T7啟動子及M片段的序列，使用Gel Extraction Kit（Omega）回收目的片段后用T7 High Yield RNA Transcription Kit（Vazyme）合成RNA標準品，用MicroElute RNA Clean Up Kit（Omega）試劑盒純化RNA標準品，隨后用酶標儀測定RNA濃度后計算拷貝數(shù)。將RNA標準品進行10倍梯度稀釋至0.5×1012-0.5×101copies/μl，采用上述反應(yīng)體系和條件對各稀釋度的RNA標準品進行實時熒光定量PCR擴增。

1.2.4 特異性實驗

將IBDV、ALV、H1N1（PR8）、H5N6、H6N1、H7N9、H9N2（3W3）病毒提核酸后作為模板，用已建立的方法對這些不同病毒的核酸進行qPCR擴增，檢測該方法的特異性。

1.2.5 野鳥糞便檢測

用本實驗建立的方法對2020年1月13日在湖北省黃梅縣龍感湖采集的100份野鳥樣本進行熒光定量PCR檢測，野鳥糞便樣本保存于含10%甘油的PBS中（含0.25%的BSA和硫酸慶大霉素，10000U青霉素、20000U鏈霉素）。樣品渦旋混勻后，4℃ 12 000 rpm離心5 min，取200 μl上清用病毒RNA/DNA提取試劑盒提取核酸后進行qPCR檢測，每個樣本設(shè)2個復(fù)孔。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物與TaqMan探針的選擇及反應(yīng)體系的確定

將實驗室設(shè)計的引物探針（M-F190/M-R407/M-P213）擴增標準質(zhì)粒后構(gòu)建標準曲線，回歸系數(shù)R2=0.997，擴增效率E=106.13%均滿足標準曲線的相關(guān)參數(shù)范圍（圖1A），但是該引物探針的擴增曲線并不滿足標準“S”型曲線，且隨著質(zhì)粒稀釋度的增加，熒光信號強度顯著降低（圖1B），因此不利于后期檢測結(jié)果的判讀。隨后將CNIC（M-F170/M-R250/M-P230）和WHO（M-F780/M-R860/M-P800）推薦的引物和探針進行了靈敏度比較，將同一流感病毒核酸分別加入上述兩種引物探針所配的體系中進行擴增反應(yīng)（體系中除了引物探針不同外，其它條件均一致），結(jié)果如圖1C所示，WHO（M-F780/M-R860/M-P800）推薦的引物和探針的擴增曲線CT值和熒光強度均優(yōu)于CNIC（M-F170/M-R250/M-P230）所推薦的引物探針。同一模板加入不同量后的擴增曲線如圖1D所示，結(jié)果表明，當模板加入量為8 μl時，CT值明顯低于5 μl和3 μl的模板投入量，因此確定體系中模板加入量為8 μl。

綜上實驗結(jié)果，選擇WHO推薦的引物和探針（M-F780/M-R860/M-P800）進行后續(xù)實驗。

2.2 特異性評價

為檢測WHO（M-F780/M-R860/M-P800）的特異性，分別用該引物擴增IBDV、ALV、H1N1（PR8）、H5N6、H6N1、H7N9、H9N2（3W3）病毒核酸，結(jié)果顯示不同亞型的流感病毒均出現(xiàn)擴增曲線，而以IBDV及ALV核酸為模板，則未出現(xiàn)擴增曲線（圖2），說明該方法對流感病毒均具有特異性。

2.3 標準曲線的建立

將3W3病毒株不同稀釋度的RNA標準品作為模板進行qPCR擴增反應(yīng)，模板濃度為1×1012-1×107copies/μl，每個稀釋度做三個復(fù)孔，擴增曲線如圖3所示。由標準曲線（圖4）可知，標準曲線方程為：y = -3.8594x + 51.563，回歸系數(shù)R2=0.9997，擴增效率為E=97.45%，擴增效率在90%～110%之間，標準曲線構(gòu)建成立。

2.4 引物靈敏度評價

將RNA標準品進行10倍梯度稀釋，使用WHO（M-F780/M-R860/M-P800）引物，模板濃度分別為1×1012-1×101 copies/μl，用該方法對每個稀釋度進行檢測，結(jié)果顯示最低檢測核酸拷貝數(shù)為100 copies/μl（圖5）。

2.5 野鳥糞便樣本的檢測

將所建立的方法對100份野鳥糞便樣本進行檢測，將兩個復(fù)孔CT值均小于40，且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本判定為陽性樣本。部分樣本的檢測結(jié)果如圖6所示。100份野鳥樣本中流感病毒核酸陽性樣本數(shù)為14，因此本次采集樣本流感病毒核酸陽性率約為14%。

3 結(jié)論與討論

野鳥禽流感病毒的自然宿主，目前已從25個科100多種野鳥（包括野鴨、大雁、天鵝等）中分離到幾乎所有亞型的禽流感病毒。野鳥的流感監(jiān)測主要采集野鳥糞便，通過傳統(tǒng)的雞胚分離來監(jiān)測禽流感病毒。由于傳統(tǒng)的雞胚分離法需要傳代3次，耗時長且工作強度大，嚴重限制了野鳥攜帶AIV的監(jiān)測效率。本研究擬在本試驗建立一種高通量、靈敏度更高的檢測方法來提高病毒檢測效率。

試驗數(shù)據(jù)表明，本研究建立的基于流感病毒M基因的實時熒光定量PCR檢測方法具有良好的特異性，對多種亞型流感病毒均能特異性檢出，而與其它病毒無交叉反應(yīng)，而且該方法可以檢測到最低拷貝數(shù)為1×102 copies/μl的病毒。建立的標準曲線顯示，擴增效率為97.45%，可對野鳥糞便這類低病毒載量的樣本進行定量檢測。

本試驗比較了不同引物對AIV的擴增效率，發(fā)現(xiàn)WHO網(wǎng)站公布的引物具有較好的擴增效率。同時，為使建立的熒光定量RT-PCR技術(shù)可以替代經(jīng)典的雞胚擴增法，對該引物的特異性和靈敏性進行了進一步的測試，對其中的實驗細節(jié)和條件進行了摸索和優(yōu)化。建立了標準曲線，方便對糞便中病毒進行絕對定量。與傳統(tǒng)的雞胚分離法相比，該方法具有更高的AIV陽性率，滿足替代傳統(tǒng)雞胚分離方法的條件之一。但是否會存在漏檢，即雞胚分離陽性的樣本是否全部為熒光定量RT-PCR技術(shù)陽性，由于測試的樣本只有100份，還需更多數(shù)據(jù)的支撐。

參 考 文 獻

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（責任編輯：唐 嵐）