Scara3介導巨噬細胞對多壁碳納米管攝取和炎癥細胞因子產生的影響

王 瓊，何佳麗，王其其，趙子悅，徐結茍

人工合成納米材料(engineered nanomaterial, ENM)進入機體后產生炎癥等異物反應。巨噬細胞對顆粒性異物的吞噬作用是一個重要防御機制。巨噬細胞的病原微生物吞噬有兩種基本方式：① 巨噬細胞膜上的模式識別受體介導的吞噬；② 調理吞噬，即巨噬細胞膜上的FcγR或補體受體介導的吞噬。ENM在體液中其表面吸附了多層蛋白質，其中包含IgG和補體，通過它們的調理作用從而促進巨噬細胞的吞噬。

多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes, MWCNT)是一種新型納米材料，具有良好的應用前景，但在動物實驗中其具有炎癥、纖維化和惡性腫瘤等肺部毒性。該課題組前期研究表明刺激小鼠巨噬細胞Raw264.7清道夫受體A成員3(scavenger receptor A member 3，Scara3)表達增高，該研究將深入探討Scara3在巨噬細胞對 MWCNT的攝取和炎癥細胞因子產生中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

納米材料MWCNT購自三井化學有限公司；SiO購自美國Sigma-Aldrich公司；TiO購自日本化妝品協會；富勒烯C60購自日本先端碳材料株式會社；TRIzol試劑購自廣州美基生物科技有限公司；HiScript? Ⅱ QRT SuperMix for qPCR試劑盒、AceQ? qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒和2×Rapid Taq Master Mix試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；siRNA、shRNA質粒均購自上海吉瑪基因有限公司；抗Scara3抗體購自美國Novusbio公司；抗Gapdh抗體購自美國Peprotech公司；電化學發光顯影液(ECL)購自賽默飛世爾科技有限公司；X-VIVO巨噬細胞無血清培養基購自比利時Lonza公司；ELISA試劑盒購自上海酶聯生物有限公司。

Polytron PT1600 E勻漿器購自瑞士Kinematica公司；JY92-2超聲粉碎儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司；LightCycler 96定量PCR儀購自美國Roche公司；NEPA21高效基因電轉儀購自日本NEPA GENE公司；凝膠數碼成像分析系統購自上海天能科技有限公司；ECLIPSE偏光顯微鏡購自尼康儀器有限公司。

1.2 細胞系及培養

小鼠巨噬細胞系Raw264.7購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。RAW264.7復蘇后，用添加了10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基在37 ℃、5% CO培養箱中培養，傳代用0.25%胰蛋白酶消化。

1.3 ENM懸液的制備

在無菌條件下分別稱取MWCNT、SiO、TiO及富勒烯C60納米材料粉末各10 mg，放入20 ml含0.5% Pluronic F-68的生理鹽水中。MWCNT懸液用勻漿器打碎(3 000 r/min)4次，每次1 min，間隔2 min。然后MWCNT及其他納米材料懸液每次使用前用超聲粉碎儀以600 W超聲處理15 min。終濃度為500 g/L。

1.4 RNA的提取、逆轉錄和定量PCR

Raw264.7細胞總RNA提取、逆轉錄和定量PCR分別采用TRIzol、HiScript? Ⅱ QRT SuperMix for qPCR和AceQ? qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進行，使用定量PCR儀分析靶基因表達情況。以GAPDH為內參，2法計算各靶基因的相對表達量。小鼠靶基因所使用的定量PCR引物見表1。

表1 引物序列

1.5 建立Raw264.7的Scara3 k/d穩定表達株

1×10個Raw264.7細胞懸于Opti-Mem中，加入1 μg Scara3 shRNA質粒 DNA(預先用3條siRNA進行預實驗，選用敲低效果最佳的序列建立shRNA質粒)，混勻后，用NEPA21高效基因電轉儀轉染。24 h后，培養基中加入800 mg/L G418進行篩選，約14 d后大部分細胞死亡，極少部分轉染成功的細胞存活形成克隆。挑取較大的細胞克隆于24孔板培養，待細胞長滿后再擴大培養來建立穩定細胞株。

對Scara3的敲低效果采用普通PCR、定量PCR和Western blot進行檢測。RNA提取、逆轉錄和定量PCR方法見1.4。普通PCR反應使用2×Rapid Taq Master Mix進行，用1 %瓊脂糖凝膠進行電泳后，使用成像分析儀器進行成像。Scara3蛋白表達采用Western blot檢測，簡述如下：20 mg總蛋白上樣進行10 % SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉膜、封閉后，加入一級抗體(抗Scara3，1∶1 000稀釋；以及抗GAPDH，1∶1 000稀釋)4 ℃過夜，TBST洗3次，然后將膜與1∶10 000稀釋的二級抗體共孵育1 h。最后使用ECL進行顯影成像。

1.6 MWCNT對巨噬細胞的暴露

取1×10個對數生長期的空載或Scara3 ShRNA穩轉的Raw264.7細胞，接種于6孔板，在含1 mg/L LPS的DMEM完全培養基培養8 h后，細胞大部分被LPS活化貼壁，吸去細胞培養上清液，更換為含10% 胎牛血清及1 mg/L LPS的X-VIVO巨噬細胞無血清培養基或含1 mg/L LPS的X-VIVO巨噬細胞無血清培養基，培養24 h后，加入10 mg/L MWCNT刺激12 h后，收取上清液和細胞分別用于Elisa和定量PCR檢測細胞因子的表達情況。

1.7 炎癥細胞因子分析

收取的細胞培養上清液3 000 r/min離心20 min，去除沉淀。上清液中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors，TNF)-α、白介素(interleukin，IL)-1β及IL-6的濃度采用ELISA試劑盒按產品說明進行測定。細胞中TNF-α、IL-1β及IL-6的mRNA表達按1.4方法進行測定。

1.8 偏振顯微鏡觀察細胞攝取

取1×10個對數生長期的空載或Scara3 ShRNA穩轉的Raw264.7細胞，接種于預先放置了細胞爬片的6孔板，在含1 mg/L LPS的DMEM完全培養基培養過夜，大部分細胞被LPS活化貼壁，輕輕吸去細胞培養上清液和未貼壁的細胞。更換培養基為添加或不加10%胎牛血清的含1 mg/L LPS的X-VIVO巨噬細胞無血清培養基繼續培養12 h，然后加入1 mg/L的MWCNT刺激12 h。細胞爬片上的細胞經4 %多聚甲醛固定20 min后進行HE染色，然后用中性樹膠封片。使用ECLIPSE偏光顯微鏡，在20倍鏡下隨機選取10個視野來觀察細胞中含有的發光MWCNT數量，然后計算含發光MWCNT的細胞數占細胞總數的百分比。

2 結果

2.1 MWCNT懸液的制備和觀察結果

為了研究MWCNT對巨噬細胞的作用，先將MWCNT干粉制成懸液。電子顯微鏡下MWCNT在懸液中仍然呈管狀，并聚集成大小不等的團塊(圖1A)，經NanoSight分析顯示這些聚集團塊的大小。見圖1B。

圖1 MWCNT的形態和大小

2.2 MWCNT誘導Scara3表達增加和建立穩定Scara3敲低的細胞系

定量PCR的結果顯示，在MWCNT刺激的Raw264.7細胞中Scara3的表達遠高于對照組和其他納米材料(SiO、TiO及富勒烯C60)刺激組(圖2A)，提示Scara3可能參與了巨噬細胞對MWCNT的吞噬以及細胞因子產生等過程。

為了闡明Scara3在巨噬細胞對MWCNT吞噬以及細胞因子產生的作用，首先采用shRNA技術建立了穩定Scara3表達敲低(Scara3 k/d)Raw264.7系。圖2B顯示2個代表性克隆Scara3的表達，其中1個克隆(克隆8)的Scara3 mRNA被明顯敲低；定量PCR表明克隆8的Scara3約為穩定轉染對照質粒(NC)細胞的10.65 %(圖2C)。Western blot進一步表明克隆8 Scara3蛋白表達也顯著下降(圖2D)。因此，隨后的研究在克隆8細胞系(Scara3 k/d組)和穩轉對照-5(NC組)細胞系上進行。

圖2 Scara3的敲低結果

2.3 Scara3敲低減少炎癥細胞因子的產生

該研究以TNF-α、IL-1β和IL-6為指標來觀察巨噬細胞對MWCNT刺激的反應。如圖3A、B和C所示，與存在血清條件相比，無血清條件時，無論是NC組還是Scara3 k/d組巨噬細胞經MWCNT刺激后所表達的TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA均有一定程度下降；而與NC相比，無論是存在還是不存在血清的條件下，Scara3 k/d都明顯降低了MWCNT誘導巨噬細胞產生的TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達水平。使用ELISA測定培養上清液中這些炎癥細胞因子的含量，結果顯示在存在和不存在血清的兩種條件下，Scara3 k/d組MWCNT刺激后，巨噬細胞產生的TNF-α和IL-1β的分泌降低(圖3D、E、F)。

圖3 Scara3敲低炎癥細胞因子的表達情況

2.4 Scara3敲低后降低對MWCNT的攝取

偏光顯微鏡技術利用光折射原理，在弱光源背景下，顆粒性材料會發出折射的光。因此，在偏光顯微鏡下可以觀察到MWCNT的分布。通過偏光顯微鏡觀察顯示，在存在血清時，NC細胞中含有MWCNT的比例較多(圖4A、E)，而Scara3 k/d細胞中的比例下降(圖4B、E)；同樣，在不存在血清時，NC細胞和Scara3 k/d細胞中該比例分別為(13.40±5.23)%和(9.29±2.11)%(圖4C、D和E)。關于吞噬率的統計學比較，血清組中Scara3 k/d與NC組比較的

P

=0.000 18，無血清組中Scara3 k/d與NC組比較的

P

=0.000 34；無血清組NC與血清組NC比較的

P

=0.000 16，無血清組Scara3 k/d與血清組Scara3 k/d比較的

P

=0.012，差異有統計學意義。

圖4 MWCNT的攝取 HE×20

3 討論

新型納米材料MWCNT在材料科學、半導體工業和生物醫學領域具有良好的應用前景，但許多研究表明MWCNT可以引起機體的炎癥反應以及其他毒性。巨噬細胞通過對MWCNT等顆粒性物質的吞噬而清除進入機體的這些顆粒性材料，起到保護機體的防御作用，但同時巨噬細胞顆粒性材料而活化后產生許多細胞因子和氧自由基，促進炎癥反應，引起細胞損傷。因此，了解巨噬細胞對MWCNT的吞噬和炎癥因子產生在研究MWCNT毒性機制和指導更安全的MWCNT等方面具有重要意義。

既往研究中通過轉錄組高通量測序，表明在納米材料刺激小鼠巨噬細胞Raw264.7基因表達譜改變中，納米材料誘導了幾個模式識別受體的表達增加，其中包含Scara3，尤其在MWCNT刺激的Raw264.7細胞中Scara3的表達量明顯增加。定量PCR的結果表明，在MWCNT刺激的Raw264.7細胞中Scara3的表達遠高于對照組和其他納米材料(SiO、TiO及富勒烯C60)刺激組，提示Scara3可能參與了巨噬細胞對MWCNT的吞噬以及細胞因子產生等過程。所以該研究通過基因沉默和偏光顯微鏡技術等方法進行研究，結果表明了巨噬細胞膜上的Scara3介導了對MWCNT的識別和攝取以及炎癥細胞因子的產生。Scara3屬于A類清道夫受體，以同源二聚體表達于質膜和內質網膜上，氧自由基誘導其表達增加。Scara3的配體主要為脂質成分，其多形性和表達異常與肥胖、冠心病等代謝疾病相關, 也與手足口疫、冠狀病毒和埃博拉病毒感染有關。最近的研究表明Scara3也介導了球形核酸納米顆粒透過表皮細胞。這些研究結果提示Scara3可以結合不同的配體，參與巨噬細胞的識別和吞噬過程。該研究表明在無血清的條件下，巨噬細胞仍能吞噬MWCNT，誘導細胞因子產生，盡管與存在血清時相比有所下降，說明了巨噬細胞除了血清中補體、IgG等調理素介導的吞噬作用以外，還有其他介導識別和吞噬MWCNT的機制。無論是存在還是不存在血清的條件下，基因沉默Scara3均會導致MWCNT吞噬和細胞因子下降，顯示Scara3可以直接識別MWCNT，或者通過識別吸附的脂質等成分，介導MWCNT吞噬和細胞因子產生。

該研究探討了巨噬細胞通過Scara3介導其對MWCNT的吞噬和炎癥細胞因子的產生。Scara3在MWCNT誘發的炎癥、纖維化和腫瘤發生中的作用值得進一步研究。