人G蛋白偶聯受體107表達載體構建及細胞定位的研究

馮 陽，賀 凡，涂珍珍，臧丹丹，倪鳴岳，周海勝,

G蛋白偶聯受體107(G protein-coupled receptor 107，GPR107)是G蛋白偶聯受體超家族成員，因尚未找到其天然配體，屬于孤兒受體。人類GPR107的cDNA最先從肺組織中獲得克隆。GPR107蛋白結構分析顯示其N-末端存在疏水的信號肽和7個跨膜區，這是G蛋白偶聯受體超家族成員的典型特征。GPR107在系統發育上高度保守，有研究表明GPR107與網格蛋白和逆轉錄蛋白VPS35結合，并且可能負責受體從內細胞室返回質膜，GPR107可能是與G蛋白結合以調節細胞內囊泡運輸的受體之一。

為了過量表達GPR107蛋白并確定其亞細胞定位，利用分子克隆技術構建質粒pCMV-Tag2B-GPR107，將其轉染至人胚腎上皮細胞(HEK 293T)，通過Western blot、激光共聚焦等方法，觀察轉染前后GPR107在體內的表達變化及其亞細胞分布，為進一步研究GPR107的功能及作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

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細胞系與載體 人胚胎腎細胞系293T細胞在該實驗室保存；真核細胞表達載體pCMV-Tag-2B購自美國Promega公司；克隆載體pMD-18T購自大連寶生物有限公司；自人cDNA文庫中獲得GPR107 cDNA的質粒(克隆號：23329)由廈門大學韓家淮教授惠贈。

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引物 根據韓家淮教授實驗室提供人GPR107基因的mRNA序列，利用Primer-BLAST在線軟件進行引物設計。根據真核表達載體pCMV-Tag 2B多克隆位點的限制性核酸內切酶，在上游和下游引物的5′端分別引入限制性核酸內切酶BamH I和Hind III的識別序列及其保護堿基。使用的引物序列為：上游引物P1，5′-CGCGGATCCGCGATGGCCGCTCTGGCGC-3′(紅色表示BamH I識別位點)；下游引物P2，5′-CCCAAGCTTGGGCACGGCGCCTTCCCAC-3′(紅色表示Hind Ⅲ識別位點)。引物由上海生物工程有限公司合成。

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主要試劑 DMEM高糖培養基、青霉素和鏈霉素雙抗混合液、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自美國Corning公司；Taq酶、PCR試劑盒、DNA Marker均購自日本TaKaRa公司；轉染試劑I′mafect購自北京Imagen公司；鼠源抗GPR107和兔源抗GAPDH抗體均購自安徽朵能生物科技有限公司；兔源抗Flag抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2 方法

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載體構建 按1∶150擴增含GPR107 cDNA的質粒菌液，培養過夜后提取質粒。以提取的質粒DNA為模板，采用PCR方法擴增GPR107 cDNA。PCR的條件是：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、100 s，72 ℃、5 min，共35個循環。瓊脂糖凝膠電泳分離目的DNA，切膠回收目的片段，與pMD18-T Vector連接構建重組克隆載體，利用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ消化pCMV-Tag 2B載體和重組的克隆載體，切膠回收目的DNA，用T4 DNA連接酶連接GPR107目的片段和pCMV-Tag 2B載體，然后轉化到感受態細胞中，平板克隆后挑取菌落擴大培養，PCR鑒定，提取質粒，經BamH Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切后，選取酶切鑒定條帶位置一致的克隆，送上海生物工程股份有限公司測序。

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細胞培養 人胚胎腎細胞系293T使用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養基，于5% CO、37 ℃恒溫培養箱中培養。

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重組質粒pCMV-Tag2B-GPR107瞬時轉染細胞 293T細胞以1×10接種于60 mm培養皿，待其貼壁后長至70%～80%密度后進行轉染，轉染前1 h，更換新鮮的完全培養基，置37 ℃、5% CO培養，同時配置轉染工作液，脂質體與DNA的比例為1∶1.5，即將4 μl I′mafect轉染試劑稀釋至100 μl不含血清的培養液中輕輕混勻、6 μg DNA稀釋至100 μl不含血清的培養液中輕輕混勻，室溫放置5 min后，將I′mafect稀釋液逐滴加入DNA稀釋液中，輕輕混勻后室溫放置20 min，將200 μl轉染工作液逐滴加入293T培養液中，6 h后更換含10% FBS的高糖DMEM，培養48 h后收取蛋白。

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Western blot實驗 轉染48 h后，收集細胞總蛋白。制備10%的SDS-PAGE凝膠，上樣后80 V恒壓待濃縮膠平齊后，120 V恒壓至最底端，恒流200 mA、90 min轉膜，4 ℃封閉5 h，4 ℃過夜孵育一抗GPR107(1∶2 000)、GAPDH(1∶5 000)。次日TBST洗滌3次,每次10 min，4 ℃ HRP標記的二抗孵育3 h，TBST洗滌3次后，ECL發光試劑反應，凝膠成像系統采集圖像，最后用Image J軟件對目的條帶進行灰度分析。

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激光共聚焦實驗 先將pCMV-Tag2B-GPR107瞬時轉染細胞至293T細胞，待24 h后取20%左右已經轉染的細胞鋪至玻底培養皿，待細胞貼壁，24 h后，棄培養基，PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min，0.3% Triton X-100透化劑透化，加入3%馬血清封閉1 h，一抗(兔源抗Flag)4 ℃孵育過夜，使用帶熒光標記Alexa Flour 647的二抗4 ℃孵育2 h，室溫染核10 min，激光共聚焦顯微鏡觀察、拍片。

2 結果

2.1 pCMV-Tag2B-GPR107載體構建結果

利用人cDNA文庫中獲得的GPR107 cDNA質粒為模板，通過PCR獲得人GPR107 cDNA(圖1A)，GPR107目的片段長度為1 659 bp，連接到克隆載體pMD18-T Vector上并將其菌液進行PCR鑒定。PCR結果顯示，提取的10個克隆中有7個克隆為陽性重組載體(圖1B)。將2號克隆進行擴增、提取質粒DNA、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，獲得與目的片段大小一致的DNA(圖1C)。將此目的DNA亞克隆到帶有Flag標簽的pCMV-Tag2B載體并進行PCR鑒定，篩選出4個陽性的重組表達載體(圖1D)，選取2號克隆進行DNA測序，將測序結果與原cDNA序列進行比對，實驗表明目的基因無突變且表達框無誤以及pCMV-Tag2B-GPR107載體構建成功。

圖1 pCMV-Tag2B-GPR107載體構建

2.2 重組質粒pCMV-Tag2B-GPR107轉染293T細胞后蛋白表達量變化

為了在細胞水平檢測GPR107的表達量變化，將pCMV-Tag2B-GPR107重組質粒轉染至293T細胞，48 h后提取蛋白，結果顯示：未轉染組GPR107蛋白相對表達量為0.28，Flag蛋白相對表達量為0.31，轉染組GPR107蛋白相對表達量為0.59，Flag蛋白相對表達量為0.81，故與未轉染組比較，轉染了pCMV-Tag2B-GPR107的實驗組GPR107的蛋白量明顯上調(

F

=28.408，

P

=0.033)；同樣轉染組Flag蛋白量也明顯上調(

F

=87.433，

P

=0.011)(圖2)。

圖2 Western blot檢測GPR107在293T細胞中的表達量

2.3 激光共聚焦顯微鏡實驗結果

為了檢測GPR107在細胞內的定位情況，將pCMV-Tag2B-GPR107轉染293T細胞，于激光共聚焦顯微鏡下觀察GPR107細胞內的分布情況，圖3結果顯示GPR107主要分布在細胞質中。

圖3 GPR107在293T細胞中的定位 ×640

3 討論

GPR107是最早從哺乳動物肺中克隆到的cDNA，屬于一個新的編碼蛋白家族的成員。人類GPR107基因位于9q34.11的常染色體區域，基因全長86.4 kb，包含18個外顯子。其蛋白質結構分析提示疏水信號肽序列位于氨基末端、一個較長的胞外結構域和7個跨膜結構域(LUSTR結構域)，這7次跨膜結構域與GPCRs相似，位于羧基末端。而在每個LUSTR亞家族中，第3個細胞內環高度保守，通常在其他GPCR的第3個細胞內環結構域參與G蛋白結合和受體信號傳遞，表明LUSTR蛋白的這一區域也參與G蛋白偶聯的信號轉導過程。因此，確定GPR107在細胞中的分布，為證實GPR107羧基末端對其細胞定位及轉運過程中的作用奠定基礎。

為了確定GPR107蛋白在細胞內分布，該研究構建了人GPR107的真核表達載體，在轉染293T細胞后獲取總蛋白進行Western blot分析，結果顯示GPR107在人293T細胞中成功過量表達。GPR107是具有7個跨膜的蛋白，既往研究表明GPR107的主要功能可能是與G蛋白結合以調節細胞內囊泡運輸。而富含囊泡的亞細胞器結構主要是分布于細胞質中的內質網和高爾基體，免疫熒光共定位結果顯示GPR107在細胞內表達主要在細胞質中，而在細胞核中未見GPR107的表達，這與文獻報道的GPR107定位于高爾基體與核質有差異，可能與GPR107表達的細胞種類有關。

既往研究表明，GPR107可能是一種神經生長抑素的候選受體，通過與神經生長抑素相互作用，在心血管功能的中樞調控中發揮重要作用，而且GPR107在胰腺組織中具有較高的表達水平。研究表明，在小鼠和人胰腺細胞上GPR107和神經生長抑素可以發生共定位，可能參與胰腺分泌進而影響消化系統的功能。此外，有報道GPR107在肝癌和前列腺癌組織中具有較高表達水平，提示GPR107可能與腫瘤的發生發展密切相關。故GPR107在293T細胞中的過表達或許也是與腫瘤有關，具體機制有待進一步研究。

GPR107在高等真核生物中普遍的表達和保守模式使得GPR107可能屬于在高爾基體中協調G蛋白依賴事件的GPCRs。通過成功構建人GPR107的真核表達載體，研究表明能在293T細胞中過量表達，并主要分布在細胞質中，為后續研究其作用機制奠定基礎。同時，需要對GPR107在不同細胞中表達定位的差異性與GPR107的功能及其作用機制進行更深入研究。