去甲腎上腺素對腹外側視前區神經元的作用途徑研究

邴利潔，張平平，程 娟，張樂莎，王烈成

腹外側視前區(ventrolateral preoptic nucleus，VLPO)是促進睡眠的中樞,其在睡眠啟動中起著重要作用。在中樞神經系統中，去甲腎上腺素(noradrenalin，NA)主要由藍斑(locus coeruleus，LC)的神經元釋放，是覺醒的重要遞質。曾有學者提出促睡眠神經元與促覺醒神經元相互抑制的假說，其控制著睡眠覺醒之間的時相轉換來維持睡眠或覺醒狀態。80% 的 VLPO 神經元為γ-氨基丁酸(GABA)能神經元和甘丙肽能神經元，向腦中與覺醒相關的眾多區域發出纖維投射，調節睡眠覺醒時相間的相互轉換，是調節睡眠-覺醒節律的關鍵因素。有研究表明，在VLPO區域中促睡眠神經元約占2/3，中間神經元約占1/3。NA能夠興奮或抑制VLPO中兩種類型神經元的興奮性。有文獻表明促睡眠神經元的激活有助于睡眠。然而，目前NA對VLPO區域的這兩類神經元的興奮和抑制作用途徑是直接作用途徑還是間接作用途徑未見報道。該研究利用全細胞腦片膜片鉗技術和RT-PCR檢測，探究NA對VLPO兩種類型神經元的興奮或抑制作用的途徑。

1 材料與方法

1.1 動物與主要試劑

實驗動物選用清潔級健康C57BL/6小鼠(15～21 d)，購自安徽醫科大學實驗動物中心，飼養于安徽醫科大學基礎生理學實驗室動物房。飼養環境：室溫22～24 ℃，相對濕度40%～60%，人工控制12 h晝夜節律，自由攝食和飲水。主要試劑有：NA購自天津金耀公司，CNQX購自美國abcam公司,AP5和 flumazenil購自美國Sigma公司，逆轉錄試劑盒購自美國promega公司。

1.2 主要儀器

MultiClamp 700B放大器、Axon Digidata 1550A數模轉換器(美國Axon公司)；振動切片機(德國Leica公司)；MODEL P-97電極拉制儀、玻璃電極(德國SUTTER設備公司); 95% O/5% CO的混合氣(合肥虹玨公司)。

1.3 方法

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電生理溶液組成 切片液(mmol/L)：124 NaCl, 3 KCl, 1.2 NAHPO, 26 NAHCO, 0.5 CaCl, 4 MgSO, 10 dextrose和5 HEPES, 滲透壓(798±10)kPa，pH(7.3±0.5), 4 ℃保存。細胞外液(mmol/L)：124 NaCl, 3 KCl, 1.2 NAHPO, 26 NAHCO, 2.4 CaCl, 1.3 MgSO, 10 dextrose和5 HEPES,滲透壓(798±10)kPa，pH(7.3±0.5),室溫使用。電極內液(mmol/L)：150 K-gluconate, 5 NaCl, 5 HEPES, 0.4 EGTA, 4 Mg-ATP, 0.5 Tris-GTP和5 phosphocreatine, 滲透壓(798±10)kPa，pH(7.2±0.5)。

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玻璃電極拉制 采用電極拉制儀拉制尖端為 1 μm、入液電阻為 3～7 MΩ的玻璃電極。

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VLPO離體腦片制備 從15～21 d的小鼠中制備含有VLPO的切片(厚度300 μm)。小鼠先吸入異氟醚使其麻醉，然后用斷頭臺斷頭。取腦，放置于含混合氣(95% O/5% CO)的4 ℃切片液中，使用振動切片機切割腦片，將切好的腦片移入含混合氣的細胞外液中孵育，25 ℃孵育1 h。將切片轉移到記錄浴槽中，加熱細胞外液至30 ℃，進行全細胞膜片鉗記錄。記錄過程中，蠕動泵維持灌流速度為2 ml/min。

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RT-PCR

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VLPO的RNA提取 小鼠吸入異氟醚麻醉后，斷頭取腦用振動切片機切片，然后對照腦圖譜，在VLPO所在的位置，采集含有VLPO的組織。每只小鼠可以取40～50 mg，從6只小鼠中取材200 mg組織，放到1.5 ml EP管中，加入1 ml TRIzol，使用勻漿器吹打研磨。研磨0.5 h后，加入0.2 ml氯仿，振蕩30 s，室溫放置2 min。12 000 r/min，4 ℃離心15 min。取上清液于新的EP管中，加0.5 ml異丙醇，振蕩30 s，室溫放置10 min。12 000 r/min，4 ℃離心15 min。棄掉上清液，加入75%乙醇1 ml，振蕩30 s，7 500 r/min，4 ℃ 離心5 min。棄上清液，用濾紙小心吸取殘留液體，室溫干燥30 min，使乙醇充分揮發。沉淀溶于20 μl DEPC水，-20 ℃保存，備用。

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RT-PCR擴增及電泳 Promega GoScript Reverse Transcription System A5000試劑盒說明書對樣本RNA進行反轉錄。PCR擴增程序為：25 ℃退火5 min；42 ℃延伸1 h；4 ℃、5 min；70 ℃延伸15 min；4 ℃保存備用。PCR擴增產物在120 V電壓下使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。引物由生工生物工程(上海)有限公司設計合成。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

2 結果

2.1 VLPO兩種類型神經元的鑒定

高倍顯微鏡觀察下，VLPO中能看到有兩種形態的神經元，一種是多極三角形(圖1A),這類神經元動作電位的發放頻率能被NA抑制(圖2A)，撤去NA后動作電位發放頻率恢復到給NA前水平，是促睡眠神經元；另一種是兩極梭形(圖1B)，這類神經元動作電位的發放頻率能被NA興奮(圖2B)，撤去NA后動作電位發放頻率同樣能恢復到給NA前水平，是中間神經元。采用全細胞膜片鉗記錄VLPO中兩種神經元的放電均是自發放電。通過VLPO細胞的不同形態和對NA的不同響應，以此鑒別促睡眠神經元和中間神經元。

圖1 小鼠腦片上VLPO中兩類不同神經元的形態

圖2 VLPO中兩種神經元對NA的不同響應

2.2 NA在阻斷劑存在下對VLPO促睡眠神經元放電效應的影響

通過顯微鏡觀察，在VLPO中選擇鉗制形態為多極三角形的細胞進行電生理記錄。正常情況下，神經元動作電位的發放是連續的。待神經元的動作電位發放穩定后開始記錄，時間記錄流程是：穩定記錄2 min后，給予NA(100 μmol/L，下同)10 s，觀察其抑制效應，然后用細胞外液灌洗2 min，恢復其自身動作電位發放頻率，然后給予不同類型阻斷劑(antagonist,下同)3 min后，在同時給予(NA+antagonist)10 s，最后用含antagonist的細胞外液灌洗至其動作電位發放頻率恢復。該研究把給予NA前20 s作為初始對照(Ctl),給NA時20 s的結果為NA的效應組(NA)，細胞外液灌洗1～2 min后的20 s為其恢復組(Wash)。Antagonist灌流3 min左右，即NA+antagonist前20 s為(Ctl+antagonist)組,給予NA+antagonist的20 s為(NA+antagonist)組，1～2 min灌洗后的20 s為(Wash+antagonist)組。Antagonist濃度分別為CNQX(10 μmol/L)、AP5(50 μmol/L)、flumazenil(5 μmol/L)，下同。當用NA鑒定細胞為促睡眠神經元時，再進行后續的實驗。統計結果如圖3所示，在CNQX+AP5存在下，給NA后的動作電位發放頻率顯著低于Ctl+CNQX+AP5時動作電位發放頻率(

P

<0.01；

n

=8)。在CNQX存在下，給NA后的動作電位發放頻率顯著低于Ctl+CNQX時動作電位發放頻率(

P

<0.001；

n

=7)。在AP5存在下，給NA后動作電位發放頻率顯著低于Ctl+AP5時動作電位發放頻率(

P

<0.001；

n

=8)。在flumazenil存在下，給NA后動作電位發放頻率顯著低于Ctl+ flumazenil時動作電位發放頻率(

P

<0.05；

n

=7)。結果說明，在CNQX、AP5、flumazenil存在的情況下，NA對促睡眠神經元的抑制作用依舊存在。

圖3 NA在阻斷劑存在下對促睡眠神經元動作電位發放頻率的效應

2.3 NA在阻斷劑存在下對VLPO中間神經元放電效應的影響

通過顯微鏡觀察，在VLPO中選擇鉗制形態為兩極梭形的細胞進行電生理記錄。待神經元的動作電位發放穩定后開始記錄，時間記錄流程和阻斷劑使用濃度同2.2。當用NA鑒定細胞為中間神經元時，再進行后續的實驗。統計結果如圖4所示，在CNQX+AP5存在下，給NA后的動作電位發放頻率與Ctl+CNQX+AP5時動作電位發放頻率比較，差異無統計學意義(

n

=8)。在CNQX存在下，給NA后的動作電位發放頻率顯著高于Ctl+CNQX時動作電位發放頻率(

P

<0.01；

n

=8)。在AP5存在下，給NA后的動作電位發放頻率與Ctl+AP5時動作電位發放頻率比較，差異無統計學意義(

n

=8)。在flumazenil存在下，給NA后的動作電位發放頻率顯著高于Ctl+flumazenil時動作電位發放頻率(

P

<0.05；

n

=7)。結果顯示，在CNQX、flumazenil存在的情況下，NA對中間神經元的興奮作用仍舊存在。然而，在AP5存在的情況下，NA對中間神經元的興奮作用消失。

圖4 NA在阻斷劑存在下對中間神經元動作電位發放頻率的效應

2.4 用不同阻斷劑預處理VLPO腦片后分析NA對VLPO神經元兩種效應介導的受體途徑

通過統計NA對動作電位發放頻率抑制率或者興奮率(%)(NA-Ctl)/Ctl×100%和給予antagonist后，NA對動作電位發放頻率抑制率或者興奮率(%)[(NA+antagonist)-(Ctl+antagonist)]/(Ctl+antagonist)×100%。比較給阻斷劑前后NA對VLPO神經元的興奮或者抑制幅度，結果顯示，在CNQX+AP5組中，中間神經元給antagonist后的動作電位發放頻率興奮率(5.223±7.26)%與給antagonist之前的動作電位發放頻率興奮率(40.470±13.59)%差異有統計學意義(

P

<0.05，

n

=9)。在AP5組，中間神經元給antagonist后的動作電位發放頻率興奮率(3.636±1.71)%與給antagonist之前的動作電位發放頻率興奮率(28.100±6.86)%差異有統計學意義(

P

<0.05，

n

=8)。而其他組差異無統計學意義。這個結果顯示，NA對中間神經元的興奮作用被AP5阻斷。說明NA對VLPO中間神經元的興奮作用是通過谷氨酸能神經元釋放谷氨酸引起的間接效應，該效應由VLPO中間神經元的NMDA受體介導。

2.5 VLPO內谷氨酸受體檢測

先吸入異氟醚使小鼠麻醉，冰上斷頭取腦，然后用振動切片機切腦，取出含有VLPO的組織放入1.5 ml的EP管中，經過提取RNA和逆轉錄的一系列操作，得到的PCR擴增產物在120 V電壓下使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖5所示。NMDA受體的3種亞型GluN2A、GluN2B、GluN1在VLPO腦區均有表達。M是DNA marker(DI2000)；GAPDH是內參。GluN2A、GluN2B、GluN1是被檢測樣本。

圖5 VLPO的RT-PCR檢測結果

3 討論

去甲腎上腺素能神經元聚集的主要核團是LC，研究表明LC在包括注意力、睡眠/覺醒和應激反應在內的許多生理功能中發揮關鍵作用。實驗通過電凝和藥理學等方法在LC腦區特異損毀或激活去甲腎上腺素能神經元，提示NA參與了睡眠和清醒行為的調節。Lu et al在他們的研究中表明，在VLPO區域注射順標示蹤物發現，VLPO的軸突對視結節乳頭區域神經元的胞體及鄰近樹突有廣泛的投射，對LC、背側及中縫核、基底前腦有少量的投射。Gallopin et al根據神經元的形態、大小、對藥物的響應、遞質的組成成功的在VLPO區域鑒定兩類神經元，一類是促睡眠神經元，這類神經元的形態呈多級三角形，覺醒一些重要的遞質如NA、5-HT對促睡眠神經元的作用是抑制的，同時它們具有低閾值發放特性(low-threshold spike, LTS)，并通過單細胞RT-PCR證實了這類神經元是甘丙肽能與 GABA能的。另一類 GABA能神經元，它是兩極梭形、NA興奮性神經元，沒有LTS特性。神經生物學研究表明，在中樞神經系統中，GABA在腦中廣泛存在，為主要的抑制性神經遞質；谷氨酸是中樞神經系統含量最高、分布最廣、作用最強的興奮性神經遞質。谷氨酸是種小分子氨基酸，這類神經遞質能夠結合包括NMDA受體、AMPA受體、紅藻氨酸受體的的多個突觸后受體。這些受體是陽離子的通道，能使帶正電的離子，如NA、K和Ca進入突觸后細胞，導致去極化從而激活神經元。因此，在實驗設計中，該課題組選取了GABA能受體阻斷劑(flumazenil)，NMDA受體阻斷劑(AP5)，AMPA受體阻斷劑(CNQX)，探究NA對VLPO兩類神經元的作用途徑。

實驗結果顯示，NA對VLPO促睡眠神經元的抑制作用均不能被flumazenil、CNQX和AP5阻斷。NA對VLPO中間神經元的興奮作用被AP5阻斷，而不能被flumazenil和CNQX阻斷。在記錄神經元自發放電過程中，任何一種阻斷劑還是藥物的作用，都會使神經元的動作電位發放頻率發生改變，這是因為神經細胞在大腦中接收著各種各樣的信號，對神經遞質和藥物的反應極其敏感。因此，NA對VLPO中間神經元的興奮作用可能是通過谷氨酸能神經元釋放谷氨酸引起的間接效應，該效應由VLPO中間神經元的NMDA受體介導。而谷氨酸神經元的類型和谷氨酸的來源及上游腦區目前還不確定，此類谷氨酸神經元可能來自視網膜的自感光神經節細胞(ipRGCs)，因為ipRGCs在腦中有廣泛的投射，包括與睡眠相關的VLPO，與非成像視覺密切相關的核團，參與介導生物節律、瞳孔對光反射、睡眠與覺醒周期等生理功能，ipRGCs在大腦中的投射末梢可以釋放谷氨酸。