褪黑素延緩糖尿病大鼠腎臟細胞衰老的機制研究

陳永昕，劉婉卿，周 青，汪 淵，王 怡，朱華慶

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發病機制和原因較為復雜，其特征是血流動力學和代謝因素的相互作用，包括高血糖水平、晚期糖基化終產物(advanced glycation end-products，AGEs)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(rein-angiotensin-aldosterone-system，RAAS)的激活，是慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)的主要病因。在DN晚期，腎功能喪失則會引發終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)，ESRD的高病死率，高致殘率給人類健康帶來巨大威脅。研究表明，受損的腎臟細胞自噬水平下降，增強自噬可以有效維持細胞內的穩定狀態，抑制腎臟纖維化。同時，DN也與腎臟組織細胞G1期停滯及衰老密切相關，而p16、p53、p21作為細胞衰老的標志物，它們均是調控細胞周期的關鍵基因，參與細胞衰老的表達調節；另有文獻顯示，激活MLCK/pMLC信號通路能夠調節氧化應激效應，促進ROS生成，引發細胞衰老。自噬與衰老都是細胞應激的反應，二者密切相關，機體衰老常伴隨著自噬水平的降低，增強自噬可以延緩衰老的發生。

褪黑素(melatonin，MLT)是由哺乳動物分泌的一種胺類激素，它可以通過直接清除自由基來實現抗氧化活性和抗炎性。同時有研究表明，MLT能增強自噬，也具有很強的抗衰老作用。該實驗以DN大鼠為對象，探究在MLT參與下腎臟細胞自噬與衰老的變化，深化MLT對腎臟抗衰老作用的認識。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD雄性大鼠15只，體質量250～300 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，12 h光照、12 h黑暗交替，溫度(22±1)℃，濕度在50%～60%條件下適應性喂養。

1.2 主要試劑

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、MLT均購自美國Sigma公司；尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)測試盒、肌酐(CRE)測定試劑盒、Masson染液均購自南京建成生物工程研究所；Western blot檢測試劑：一抗MLCK、Anti-p62抗體均購自美國Santa Cruz公司；Anti-beta Actin、Anti-p21、Anti-p16、Anti-p53、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP均購自英國Abcam公司；LC3B購自美國CST公司；BCA試劑盒、細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒均購自上海碧云天生物技術公司。

1.3 主要儀器

-80 ℃超低溫冰箱(日本SANYO電器股份有限公司)；酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；全自動數碼凝膠成像系統(上海歐翔公司)；磁力攪拌器(北京中興偉業儀器有限公司)；pH儀(上海雷磁儀器廠)；冰凍切片機(德國Leica公司)；正置生物顯微鏡(德國Leica公司)。

1.4 方法

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造模方法及實驗分組 SD大鼠經適應性喂養后，隨機分為正常組、模型組和MLT組，各5只。模型組和MLT組一次性腹腔內注射劑量為55 mg/kg 的STZ，正常組注射等體積的枸櫞酸緩沖液。48 h后空腹尾靜脈取血，測得血糖≥16.7 mmol/L，造模成功。MLT組腹腔注射MLT 10 mg/(kg·d)，正常組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水，共飼養16周。

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標本采集及處理 首先稱取SD大鼠體質量，采用乙醚麻醉后固定在實驗板上，找到主動脈，取主動脈血注入裝有肝素的抗凝管，靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min，取血清后做好標記并置于-20 ℃冰箱待測。用剪刀剪開大鼠腹部，找到腎臟組織，剪刀剪下，置于預冷的PBS緩沖溶液中漂洗3次，洗去血和殘余結締組織，濾紙除去殘余水分，一部分經液氮急速冷凍，另一部分采用最佳切削溫度化合物(optimal cutting temperature compound，OCT)包埋劑冰凍包埋后切片，每片厚度為5 μm，均儲存于-80 ℃冰箱中備用。

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血肌酐和BUN 取標記好的血清，檢測各組血肌酐(serum creatinine，SCR)和BUN水平。SCR：在96孔板上，每孔分別加入6 μl樣本、180 μl酶溶液A，37 ℃下孵育5 min，于546 nm波長測定吸光度值A1，再加入60 μl酶溶液B，再次測定吸光度值A2，根據說明書公式計算肌酐值；BUN：按說明書配置好各試劑，取20 μl待測樣本加入250 μl緩沖酶液中，混勻后37 ℃準確水浴10 min，然后加入酚顯色劑和堿性次氯酸鈉各1 ml，充分混勻后37 ℃水浴10 min，640 nm波長下測定吸光度值，根據公式計算BUN含量。

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Masson染色觀察 從-80 ℃冰箱取腎組織冰凍切片，按常規方法進行Masson染色，光鏡下觀察腎組織病理學變化。

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β

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半乳糖苷酶(SA

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β

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gal)染色 取腎組織冰凍切片，按說明書步驟進行SA-β-gal染色，光鏡下觀察藍色沉淀。

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Western blot檢測法 取保存于冰箱中的腎臟組織，稱取0.1 g，PBS漂洗后，用濾紙除去殘余水分，用剪刀剪碎后轉入研磨器中，加入1 ml蛋白裂解液(含PMSF，1∶1 000)，置于冰上充分研磨至勻漿，再轉至EP管中，反復凍融3次，4 ℃離心機14 000 r/min離心30 min后取上清液。采用BCA法測定蛋白濃度后，加蛋白裂解液調配成等體積同濃度的樣本，再加入蛋白上樣緩沖液，混勻后于沸水中煮10 min至變性，-80 ℃保存。配置SDS-PAGE凝膠，各組樣本等量上樣進行電泳，電泳完成后將蛋白轉至PVDF膜上，轉膜完成后置于搖床上，以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。一抗p21(1∶1 000)、p16(1∶1 000)、p53(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、4 ℃ 孵育過夜，TBST緩沖液洗膜后二抗(1∶5 000)室溫下孵育2 h。TBST洗膜，配置顯影劑進行顯影。以QuantityOne軟件分析各條帶灰度值，參照β-actin計算相對灰度值。

2 結果

2.1 MLT干預后對DN大鼠腎臟組織SCR、BUN水平的影響

模型組大鼠與正常組比較，BUN、SCR水平均有增高(

P

<0.05)；MLT治療后，與模型組比較，MLT組BUN、SCR水平均有下降(

P

<0.05)。見表1。

表1 MLT對DN大鼠BUN及SCR水平影響

2.2 Masson染色結果

與正常組比較，模型組DN大鼠腎間質纖維化明顯；經MLT治療后，膠原纖維染色陽性率顯著下降。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織Masson染色 ×200

2.3 SA-β-gal染色結果

與正常組比較，模型組DN大鼠腎組織細胞出現明顯的SA-β-gal染色陽性；與模型組比較，MLT組SA-β-gal染色陽性率顯著下降。見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織SA-β-gal染色 ×200

2.4 MLT干預后對DN大鼠腎臟組織p62、LC3B蛋白表達水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織中p62蛋白水平升高(

P

<0.05)，LC3B蛋白水平降低(

P

<0.05)；MLT治療后，DN大鼠腎臟組織中p62蛋白表達水平下降(

P

<0.05)，LC3B蛋白表達水平升高(

P

<0.05)。見圖3。

圖3 Western blot檢測腎臟組織中p62、LC3B表達情況

2.5 MLT干預后對DN大鼠腎臟組織MLCK表達水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織中MLCK蛋白表達水平升高(

P

<0.05)；MLT治療后，DN大鼠腎臟組織的MLCK表達水平下降(

P

<0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測腎臟組織中MLCK表達情況

2.6 MLT干預后對DN大鼠腎臟組織p16、p52、p21表達水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織中p16、p52、p21蛋白表達水平均有升高(

P

<0.05)；MLT治療后，DN大鼠腎臟組織中p16、p52、p21蛋白表達水平均有下降(

P

<0.05)。見圖5。

圖5 Western blot檢測腎臟組織中p16、p53、p21表達情況

3 討論

DN是造成CKD和ESRD的主要原因之一，針對糖尿病患者的既定治療方案包括控制血糖、膽固醇和高血壓等，但這些方案對ESRD及其帶來的心血管風險并不能提供完全的保護。因此，研究DN發病機制并尋找新的更有效的治療方法具有重要意義。DN是典型的細胞衰老相關性疾病，在其發展過程中涉及的機制都與衰老密切相關。研究細胞衰老在DN中的新興作用，靶向延緩或阻斷衰老的治療方法也被認為是治療DN的一種很有前景的新策略。

衰老和自噬都是細胞對外界刺激因素的應激反應，活性氧刺激、炎癥等都會引發細胞衰老、激活自噬。細胞衰老往往伴隨自噬水平的降低，恢復自噬可以延緩衰老的進展。自噬是胞內依賴溶酶體途徑清除、降解未折疊或折疊錯誤蛋白質及受損細胞器的過程，對維持細胞自身穩態、延續細胞生命至關重要。在溶酶體降解過程中，p62與底物結合后被蛋白水解酶降解，LC3B則參與自噬小體的形成，通過自噬標記物p62和LC3B可以直接反應自噬水平的變化。細胞衰老最明顯的特征是細胞分裂進入不可逆的細胞周期阻滯狀態。p53-p21-RB信號通路和p16INK-RB信號通路主要負責調控細胞周期，激活這2條通路會導致p53蛋白、p21蛋白、p16蛋白高表達，進而加速細胞衰老的進程。研究表明，p53上調會加重自噬抑制，腎纖維化與p53呈正相關，與LC3B呈負相關。p21則是p53的下游基因，其編碼的蛋白可以通過C端與增殖細胞核抗原(PCNA)結合，使PCNA無法活化DNA聚合酶，進而抑制DNA的合成；另一方面p21蛋白還可以使視網膜母細胞瘤(RB)無法磷酸化，阻斷RB-E2F信號通路，無法激活細胞分裂轉錄因子，從而阻滯細胞G1期，使腎臟細胞向衰老樣表型發展，同時抑制腎小管細胞的增殖。p16則通過結合和抑制細胞周期素依賴激酶4和6(CDK4/6)來阻止細胞增殖，誘導細胞衰老，而p16的降解和定位依賴于自噬途徑。

MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)信號通路調節包括應激、炎癥在內的諸多病理效應，其中一條重要支路為細胞外信號調節激酶(ERK)，研究表明，ERK活化可以促使肌球蛋白輕鏈(MLC)在肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)的介導下磷酸化，帶來一系列連鎖反應，抑制MLCK可以顯著降低細胞從靜止狀態向增殖狀態轉變，作為負細胞調節因子的p16在轉變過程中核表達水平也出現顯著變化。近年來，有實驗表明，NADPH氧化酶(NOX)衍生的ROS能促進高脂血癥中循環內皮祖細胞(EPC)的衰老和功能障礙，其中NOX的上調和ROS的增加則依賴于MLCK信號通路的磷酸化，另有研究稱AGEs也通過相關途徑參與調節內皮細胞衰老。

MLT是一種有較強的生物活性的內源性激素，參與生理和神經內分泌功能的晝夜節律調節，相比于化學合成藥物，對機體的副作用小，能維持細胞膜的穩定,具有增強自噬、抗氧化、抗炎癥、抗衰老等諸多功能。在成功構建大鼠DN模型并給予MLT干預后，該實驗檢測了DN大鼠血清中BUN、SCR的含量，與模型組比較，MLT組的BUN和SCR水平均有下降，表明腎功能在MLT治療后得到了改善；隨后采用Masson染色觀察了腎組織的病理變化，結果顯示，MLT有效地減緩了腎損傷。MLT能誘導細胞增強自噬，為了研究MLT是否通過誘導自噬保護了腎臟細胞，該研究對自噬標志物p62、LC3B進行了測定。數據表明，模型組中自噬相關蛋白LC3B表達水平降低，p62水平升高，自噬受到抑制。經MLT治療后，LC3B表達水平升高，p62表達水平降低，自噬異常得到改善。該研究又采用了β-半乳糖苷酶(衰老標志物之一)染色法檢測了腎臟細胞，結果表明MLT組細胞衰老情況有明顯的改善。既往實驗表明，MLT在動脈粥樣硬化等心血管疾病中能通過p38/MAPK信號通路下調MLCK表達保護心肌細胞；在骨質疏松癥中，能通過降低p16表達延緩衰老。該實驗采用Western blot法檢測了MLCK和p16，結果顯示MLT組MLCK、p16較模型組有所下降。MLT可能通過抗衰老保護了DN大鼠腎臟組織，該實驗又進一步檢測了腎臟組織中的細胞衰老標志物p53和p21。與正常組比較，模型組中p53、p21表達水平均有升高；經MLT治療后，p53、p21表達水平顯著下降。因此，推測MLT在腎臟組織中可能通過增強自噬、延緩衰老保護DN腎臟。然而，自噬與DN發病機制的關系仍然需要探究，p53、p21、p16也受多種信號因子調控，未來有必要進一步研究MLT在保護腎臟細胞過程中的具體作用，這對治療DN尋找可能的靶點有著重要的意義。