兔伸直型膝關(guān)節(jié)攣縮模型中肌源性攣縮的病理特征及其機(jī)制研究

楊 帆，黃鵬鵬，周 云，張全兵，王 鋒，劉阿英，陳 爽，徐齊宇

臨床上膝關(guān)節(jié)損傷治療中，常常需要輔以膝關(guān)節(jié)功能位或伸直位固定，而不恰當(dāng)或長(zhǎng)時(shí)間固定制動(dòng)是關(guān)節(jié)攣縮的一個(gè)重要因素，如不早期進(jìn)行干預(yù)，一旦膝關(guān)節(jié)攣縮發(fā)展至后期，即使手術(shù)也難以恢復(fù)正常關(guān)節(jié)活動(dòng)度(range of motion,ROM)。因此，制動(dòng)引起的膝關(guān)節(jié)攣縮已成為臨床工作中常見(jiàn)難題。

研究表明，在制動(dòng)早期，限制關(guān)節(jié)活動(dòng)的主要原因?yàn)榧≡葱砸蛩?肌肉、肌膜、肌腱等)，之后隨著固定時(shí)間延長(zhǎng)關(guān)節(jié)源性因素(關(guān)節(jié)囊、關(guān)節(jié)軟骨、韌帶等)逐漸占據(jù)主導(dǎo)，且ROM恢復(fù)愈加困難。所以，闡明早期肌源性攣縮和其病理變化規(guī)律，并探討其中分子機(jī)制，對(duì)于早期預(yù)防和治療關(guān)節(jié)攣縮具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

該實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：LLSC20190761)。該研究使用的30只雄性骨骼發(fā)育成熟的新西蘭白兔(安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合肥，中國(guó)；3～4月齡，體質(zhì)量2～2.5 kg)，單籠飼養(yǎng)在室溫、自然光照的環(huán)境中，并且被允許在籠內(nèi)自由地活動(dòng)和獲取水、食物。所有兔按照每組6只隨機(jī)分為以下5組：對(duì)照組(I-0組)不進(jìn)行石膏固定、石膏固定1周組(I-1組)、固定2周組(I-2組)、固定4周組(I-4組)、固定8周組(I-8組)。在各個(gè)固定時(shí)間點(diǎn)結(jié)束后兔被安樂(lè)死，并進(jìn)行取材以及相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑

光學(xué)顯微鏡購(gòu)自廈門(mén)麥克奧迪公司；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；病理組織包埋機(jī)購(gòu)自常州中微電子有限公司；Masson染色試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；TRIs購(gòu)自上海生物工程有限公司；蛋白上樣buffer、標(biāo)準(zhǔn)BSA購(gòu)自于美國(guó)Thermo公司；二甲苯Ⅰ溶液、二甲苯Ⅱ溶液、PVDF膜以及兔抗TGF-β1、HIF-1α和過(guò)氧化物酶綴合的親和性山羊抗兔IgG-HRP抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物公司。

1.3 方法

1

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3

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1

動(dòng)物造模 采用該課題組之前使用的石膏固定模型。簡(jiǎn)單地說(shuō)，實(shí)驗(yàn)人員用耳靜脈注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉兔后，用管型石膏從兔左側(cè)腹股溝到近端腳趾進(jìn)行單側(cè)膝關(guān)節(jié)伸直固定。

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3

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2

ROM測(cè)量 在每個(gè)固定的時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)耳靜脈注射過(guò)量戊巴比妥鈉對(duì)兔進(jìn)行安樂(lè)死后，實(shí)驗(yàn)員從兔左后肢的髖關(guān)節(jié)脫臼并完全切除，使用團(tuán)隊(duì)研制的關(guān)節(jié)動(dòng)度測(cè)量?jī)x進(jìn)行兔固定側(cè)后肢的ROM測(cè)量。簡(jiǎn)單地說(shuō)，實(shí)驗(yàn)員通過(guò)固定夾與金屬圓盤(pán)的平臺(tái)固定兔左后肢的股骨、脛骨和其肌肉附著點(diǎn)的近端和遠(yuǎn)端。在測(cè)量膝ROM時(shí)，實(shí)驗(yàn)員使用標(biāo)準(zhǔn)扭矩為0.077 N·m轉(zhuǎn)動(dòng)驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)盤(pán)并間接地轉(zhuǎn)動(dòng)脛骨，可通過(guò)數(shù)字測(cè)力計(jì)控制所施加的力，并且可根據(jù)轉(zhuǎn)盤(pán)的刻度確定股骨和脛骨之間的ROM變化(圖1)。2名實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行ROM測(cè)量，并對(duì)每個(gè)膝關(guān)節(jié)重復(fù)測(cè)量3次。在該研究中，屈曲角越大代表攣縮程度或運(yùn)動(dòng)損失越小。膝關(guān)節(jié)屈曲的ROM丟失值被稱為總攣縮，肌切開(kāi)術(shù)后的屈曲ROM的丟失值稱為關(guān)節(jié)源性攣縮。根據(jù)之前的研究，肌源性攣縮為總攣縮和關(guān)節(jié)源性攣縮的差值。

1

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3

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3

組織準(zhǔn)備和Masson染色 測(cè)量ROM后立刻切取兔左側(cè)股直肌。肌肉標(biāo)本使用梯度乙醇脫水，然后石蠟包埋。在切片機(jī)上取5.0 μm進(jìn)行切片，脫蠟，進(jìn)行Masson染色，觀察肌纖維萎縮和膠原沉積情況。使用倒置顯微鏡在400倍放大的條件下觀察染色的切片，對(duì)5個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域進(jìn)行分析比對(duì)，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算肌橫截面積(cross sectional area，CSA)和膠原沉積面積百分比。其他樣品在液氮中快速冷凍，然后在-70 ℃下儲(chǔ)存，用作后續(xù)的分子檢測(cè)。

1

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3

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4

蛋白提取和Western blot檢測(cè) Western blot分析TGF-β1和HIF-1α蛋白水平。采用RIPA裂解緩沖液在冰上提取股直肌標(biāo)本中的總蛋白。采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。隨后，在10%的聚丙烯酰胺凝膠上用SDS-PAG凝膠電泳分離每對(duì)樣品的等量蛋白質(zhì)，并將其電沉積到聚偏二氟乙烯膜(微孔)中。用5%脫脂牛奶溶解于TBST中室溫孵育90 min后，將膜與兔抗TGF-β1(1∶2 000)，兔抗HIF-1α(1∶1 000)和兔抗GAPDH多克隆抗體(1∶5 000)在4 ℃孵育過(guò)夜。第2天，在TBST溶液洗10 min，洗滌3次后，在室溫下用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(1∶10 000)作為二次抗體，將膜孵育40 min。每10 min用TBST清洗3次后，根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)，用化學(xué)發(fā)光劑系統(tǒng)檢測(cè)膜。用Image J軟件定量分析各譜帶密度，用GAPDH對(duì)TGF-β1和HIF-1α譜帶密度進(jìn)行歸一化。

2 結(jié)果

2.1 攣縮ROM

在總攣縮中，各組間比較

F

值=822.552，固定8周內(nèi)每個(gè)固定組與前1個(gè)固定組比較，其攣縮角度隨著固定時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加(

P

<0.001)；在肌源性攣縮中，各組間比較

F

值=367.736，每個(gè)固定組在前4周內(nèi)的攣縮角度隨著固定時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加(I-1組與I-0組相比：

P

<0.001；I-2組與I-1組相比：

P

<0.001；I-4組與I-2組相比：

P

=0.031)，但固定4周后I-4組和I-8組相比，攣縮角度增加差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

=0.192)(圖1和表1)。

圖1 總攣縮、肌攣縮和關(guān)節(jié)動(dòng)度測(cè)量?jī)x

表1 5組新西蘭兔各測(cè)量指標(biāo)比較

2.2 Masson染色及定量結(jié)果

各組CSA如圖2和表1所示。定量結(jié)果中，各組間比較

F

值=28.911，在4周內(nèi)每個(gè)固定組的股直肌橫截面積相較于前一個(gè)固定組不斷降低(I-1組與I-0組相比：

P

<0.001；I-2組與I-1組相比：

P

=0.037；I-4組與I-2組相比：

P

=0.016)，但在固定4周后，I-8組相比I-4組的降低差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

=0.430)；類似地，膠原纖維沉積占比在固定4周內(nèi)，每個(gè)固定組相較于前一個(gè)固定組不斷升高(I-1組與I-0組相比：

P

<0.001；I-2組與I-1組相比：

P

=0.020；I-4組與I-2組相比：

P

<0.001)，但固定4周后I-8組相比I-4組增加差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

=0.076)，各組間比較

F

值=164.266。

圖2 Masson染色和定量結(jié)果

2.3 HIF-1α和TGF-β1的蛋白表達(dá)

在固定4周內(nèi)，每個(gè)固定組的股直肌HIF-1α蛋白表達(dá)水平相較于前一個(gè)固定組不斷升高(I-1組與I-0組相比：

P

<0.001；I-2組與I-1組相比：

P

=0.002；I-4組與I-2組相比：

P

<0.001)，但4周后I-4組和I-8組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

=0.201)，各組間比較

F

值=132.491；在2周內(nèi)，股直肌TGF-β1蛋白表達(dá)增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(I-1組與I-0組相比：

P

<0.001；I-2組與I-1組相比：

P

<0.001)，2周后每個(gè)固定組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(I-4組與I-2組相比：

P

=0.221；I-8組與I-4組相比：

P

=0.112)，各組間相比

F

值=53.302(圖3)。

圖3 HIF-1α和TGF-β1相對(duì)于GAPDH蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

關(guān)節(jié)攣縮一旦發(fā)展至后期，目前臨床措施都難以實(shí)現(xiàn)關(guān)節(jié)功能的較大恢復(fù)，嚴(yán)重限制患者的日常活動(dòng)。因此，預(yù)防和治療早期肌攣縮的發(fā)生和發(fā)展對(duì)延緩甚至逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)攣縮的進(jìn)程極為重要。該研究通過(guò)兔膝關(guān)節(jié)伸直型攣縮模型，探討在關(guān)節(jié)固定早期所致的肌攣縮過(guò)程中的病理特征變化及可能機(jī)制。

該研究的Masson染色顯示，在固定4周之前，骨骼肌的膠原沉積隨著固定時(shí)間延長(zhǎng)不斷增加，而骨骼肌的CSA隨著固定時(shí)間延長(zhǎng)不斷降低，且改變差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但4周至8周的改變，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明在早期肌源性攣縮的病理特征為骨骼肌纖維化和萎縮，并且這個(gè)病理特征在4周時(shí)達(dá)到穩(wěn)定。有研究表明，骨骼肌的纖維化表現(xiàn)為肌內(nèi)和肌肉結(jié)締組織過(guò)度堆積，導(dǎo)致肌肉伸展性下降。在該實(shí)驗(yàn)中，固定所致的骨骼肌收縮減少，使得肌膜彈性降低變硬。同時(shí)，持續(xù)的關(guān)節(jié)固定導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)膠原組織異常堆積，造成骨骼肌纖維化加劇，使得肌肉延展性進(jìn)一步降低。此外，骨骼肌在固定后也會(huì)造成廢用性肌萎縮，也會(huì)限制關(guān)節(jié)活動(dòng)。因此，固定后引起的骨骼肌纖維化和廢用性肌萎縮是肌源性攣縮的最主要病理特征，并且這種病理特征在早期進(jìn)展迅速，后期進(jìn)展緩慢。這個(gè)病理特征的變化規(guī)律對(duì)于以后選擇早期干預(yù)肌攣縮的時(shí)間點(diǎn)提供了重要參考。

眾所周知，低氧及HIF-1α的過(guò)表達(dá)是成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化和促纖維化因子TGF-β1激活的重要啟動(dòng)子，在眾多臨床纖維化疾病中都可以找到其作用機(jī)制。該實(shí)驗(yàn)中，兔肢體被石膏長(zhǎng)時(shí)間固定后，血流逐漸減少，造成局部缺血，導(dǎo)致肌肉毛細(xì)血管數(shù)量減少，使固定側(cè)肢體處于低氧狀態(tài)。蛋白檢測(cè)中固定組的HIF-1α蛋白相對(duì)于對(duì)照組都是高表達(dá)說(shuō)明了制動(dòng)后的骨骼肌處于低氧狀態(tài)，也表明其可能是造成肌攣縮不斷增加的潛在分子機(jī)制。此外，TGF-β是多功能的細(xì)胞因子，有3種亞型，其中TGF-β1與纖維化的關(guān)系最為密切。有研究表明，TGF-β1可激活成纖維細(xì)胞，使其分泌大量膠原，促進(jìn)纖維化結(jié)締組織異常堆積。并且持續(xù)的TGF-β1刺激可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞合成及細(xì)胞外基質(zhì)沉積的時(shí)間延長(zhǎng)和增加，加劇攣縮的發(fā)展。該課題組在之前關(guān)節(jié)攣縮模型中表明，關(guān)節(jié)囊中的TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)隨著固定時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增高，也表明了促纖維化因子TGF-β1在關(guān)節(jié)攣縮的發(fā)生發(fā)展中的重要作用。該研究中骨骼肌TGF-β1蛋白高表達(dá)在第2周以后進(jìn)入穩(wěn)定期，這和Kubo et al的研究在大鼠被固定后，骨骼肌中因子TGF-β1mRNA表達(dá)在第1周即高表達(dá)且進(jìn)入穩(wěn)定期的結(jié)果不完全一致，其可能是由于模型固定方法不同以及其檢測(cè)的TGF-β1mRNA的表達(dá)和最終的蛋白表達(dá)并非一定相同原因所致。進(jìn)一步結(jié)合HIF-1α的蛋白表達(dá)隨著固定時(shí)間不斷增高，并在固定4周后進(jìn)入穩(wěn)定期，可以推測(cè)低氧和促纖維化因子TGF-β1過(guò)表達(dá)是早期造成肌攣縮病理特征改變的潛在分子機(jī)制。

該研究通過(guò)攣縮角度變化表明，固定1周后關(guān)節(jié)活動(dòng)即發(fā)生明顯的受限，且總攣縮隨著固定時(shí)間的發(fā)展逐漸增加；肌攣縮隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)也在增加，但其在4周后趨于平衡，這與一些固定誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)攣縮研究結(jié)果類似。結(jié)合上述病理和蛋白分子結(jié)果顯示，肌源性攣縮的發(fā)展與骨骼肌纖維化和萎縮的病理特征改變密切相關(guān)，均在固定4周后進(jìn)入穩(wěn)定期，而且其主要分子機(jī)制也有著類似的變化。相信這為未來(lái)干預(yù)肌源性攣縮的措施提供重要時(shí)間參考和靶點(diǎn)選擇。