沉默HE4對結腸癌細胞增殖、侵襲、凋亡和JAK/STAT3信號通路的影響

王 韜，王一飛，李 磊，田寶華，李 璐，費建東

結腸癌是消化系統中最常見的惡性腫瘤之一。人附睪蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)在肺癌、乳腺癌、卵巢癌和子宮內膜癌中高表達，并且參與了腫瘤的惡性增殖和進展。HE4在結腸癌中的報道相對較少，Kemal et al研究表明，結直腸癌患者外周血清中HE4表達水平明顯高于健康人，對結直腸癌的早期診斷有一定價值。趙淵博 等應用表面增強激光解吸電離飛行時間質譜蛋白質芯片聯合激光顯微切割技術，證實了HE4是大腸癌肝轉移的早期標志蛋白。Janus激酶/信號轉導子和轉錄激活子3(janus kinase/signal transducers and activators of transcription 3，JAK/STAT3)信號通路與結腸癌細胞的進展密切相關，HE4可以靶向調控JAK/STAT3信號通路。該研究旨在探討沉默HE4對結腸癌細胞增殖、侵襲、凋亡和JAK/STAT3信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

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細胞 結腸癌細胞株Caco-2、SW480、HT-29、HCT-116和正常結腸上皮細胞株HCoePic均購自中科院上海細胞庫。

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儀器 胎牛血清和DMEM培養基購自上海生工生物工程股份有限公司；BCA蛋白定量檢測試劑盒、凝膠快速制備試劑盒、SP免疫組化試劑盒均購自武漢艾美捷科技有限公司；HE4、JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、β-actin內參抗體均購自北京安諾倫生物科技有限公司；LipoFiterTM脂質體轉染試劑購自上海科維創生物科技有限公司；HE4 si-RNA和si-control均購自上海吉馬制藥有限公司；CCK-8試劑盒、Transwell小室、Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒均購自上海滬震實業有限公司。

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試劑 Axio Imager M2M全自動顯微鏡為德國卡爾蔡司公司生產；164-5050型電泳儀、CFXConnect熒光定量PCR儀和680型酶標儀均為美國Bio-Rad公司生產；VILBER INFINITY 3026凝膠成像系統為法國VILBER公司生產；FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀為美國BD公司生產。

1.2 細胞培養

細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養液中進行培養，置于37 ℃、5 % CO培養箱中。當細胞融合度達80%時進行傳代，用胰蛋白酶消化，以1∶3傳代。取對數生長期且生長狀態良好的細胞進行后續實驗。

1.3 病例資料

選取2016年 6月—2018年6月在該院擇期根治術治療的結腸癌患者124例，術前均未接受放化療，術后均經組織病理學檢查確診。術前采集患者晨起空腹肘靜脈血，1 500 r/min、4 ℃條件下離心15 min，收集血清，存儲于-70 ℃冰箱。術中留取癌組織及配對的癌旁正常黏膜組織(距離癌組織≥5 cm)，迅速放于液氮中冷凍，存儲于-70 ℃冰箱。124例患者中男72例，女52例；年齡46～78(56.03±10.03)歲。另選取同期在該院進行健康體檢的正常人40例作為健康對照，入組時抽取空腹肘靜脈血，留存血清，其中男29例，女21例；年齡33～64(55.10±8.78)歲。所有受試者均簽署知情同意書。

1.4 Western blot檢測細胞和組織中HE4的表達水平

細胞：取對數生長期細胞，加入細胞裂解液，冰上裂解20 min后再離心15 min，收集細胞上清液。用BCA法檢測蛋白濃度。經SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白轉移至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗(鼠抗人HE4單克隆抗體，1∶500)，4 ℃過夜后棄去一抗，TBST洗膜3次。隨后室溫孵育二抗，2 h后棄去二抗，TBST洗膜3次。以β-actin作為內參，用ECL發光儀對蛋白進行成像，用Image J軟件分析灰度值。組織：隨機選取6例癌組織和癌旁組織進行檢測。取組織100 mg加入組織裂解液，充分研碎后冰上裂解20 min，離心15 min，收集上清液。其余步驟同上。

1.5 免疫組織化學染色法檢測組織中HE4的表達水平

124例組織石蠟標本由該院病理科完成(石蠟切片厚度為4 μm)，取石蠟切片，常規脫蠟水化。將切片放置于枸櫞酸鹽緩沖液中微波煮沸5 min，冷卻至室溫。用PBS洗滌2次，再用蒸餾水洗滌2次。滴加3 %過氧化氫除去內源性過氧化物酶，室溫孵育10 min。隨后用山羊血清封閉10 min，滴加鼠抗人HE4單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。滴加生物素標記的二抗，37 ℃下孵育1 h，用PBS洗滌3次。滴加DAB顯色液，蘇木精復染。經過脫水、透明、封片處理后在顯微鏡下觀察。根據細胞的染色強度及陽性細胞比例判斷HE4表達情況：① 陰性染色記0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；② 陽性細胞數為0%～10%記1分，11%～50%記2分，51%～80%記3分，81%～100%記4分。將上述2個評分相乘得出最終結果：0～3分為HE4低表達；4～12分為HE4高表達。

1.6 ELISA法檢測血清中HE4的表達水平

嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，酶標儀檢測時波長設置為450 nm，通過繪制標準曲線計算血清HE4表達水平。

1.7 細胞轉染

以2×10個/孔密度將HT-29細胞接種于6孔板中。轉染前用PBS洗滌細胞2次，加入1.8 ml無血清培養基。分別用100 μl無血清培養基稀釋10 μl LipoFiter和10 ml HE4 si-RNA(或者si-control)，靜置5 min后將二者混勻，隨后將混合物加入6孔培養板中。轉染24 h后進行后續實驗。HE4 si-RNA序列為5′-CTCGCTATTCTCGTACCTTCC-3′；si-control序列為5′-GGACGTCCCCACGGCCCTGGAGG-3′。

1.8 CCK-8細胞增殖實驗

將HT-29細胞以1×10個細胞/孔的密度接種于24孔板中，用CCK-8試劑盒檢測細胞活性，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。細胞培養24、48、72和96 h后，向每孔中添加10 μl CCK-8，培養4 h。用酶標儀在490 nm波長處讀取吸光度，反映細胞增殖活性。

1.9 Transwell小室實驗檢測HT-29細胞侵襲

首先在Transwell遷移板上室鋪基質膠，然后將HT-29細胞接種于Transwell小室，以2×10個/ml密度將HT-29細胞加入上室；下室中加入培養基。培養48 h后取出小室，用棉簽拭去微孔膜上室的細胞。用PBS沖洗小室3遍。用4 %多聚甲醛固定黏附于下室微孔膜下面的細胞，用結晶紫染色15 min，待干燥后用顯微鏡進行觀察，并計算侵襲細胞數。

1.10 Annexin-V-FITC/PI流式細胞術檢測HT-29細胞凋亡

取轉染24 h后處于對數生長期的HT-29細胞，制成1×10個/ml的細胞懸液。隨后加入5 μl異硫氰酸熒光素，混勻后孵育15 min；再加入2.5 μl碘化丙啶，孵育5 min。最后用流式細胞儀檢測凋亡率。

1.11 Western blot檢測HT-29細胞中JAK/STAT3通路相關蛋白的變化

檢測方法同1.4。實驗中JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗體稀釋500～1 000倍。

2 結果

2.1 HE4在結腸癌細胞、組織和外周血中的表達

結腸癌Caco-2、SW480、HT-29、HCT-116細胞的HE4蛋白相對表達量均高于正常結腸上皮細胞HCoePic，差異有統計學意義(

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=56.893，均

P

<0.05，圖1A)。結腸癌組織HE4蛋白相對表達量高于癌旁組織，差異有統計學意義(

P

<0.05，圖1B)。免疫組織化學染色結果顯示，HE4在結腸癌組織中呈陽性表達，組間比較差異有統計學意義(

P

<0.05，圖1C)。結腸癌患者血清HE4濃度高于健康人，差異有統計學意義(

P

<0.05，圖1D)。

圖1 HE4在細胞、組織和血清中的表達

2.2 結腸癌組織中HE4表達水平與臨床病理特征的關系

HE4表達水平與性別、年齡、腫瘤大小無關，而與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關(

P

<0.05)。見表1。

表1 結腸癌組織中HE4表達水平與臨床病理特征的關系

2.3 沉默HE4對HT-29細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

沉默HE4后，HT-29細胞的HE4蛋白表達水平下降(圖2)。si-control組細胞增殖活力高于HE4 si-RNA組，差異均有統計學意義(

P

<0.05，圖3A)。si-control組侵襲細胞數高于HE4 si-RNA組，差異有統計學意義(

P

<0.05，圖3B)。si-control組凋亡率低于HE4 si-RNA組，差異有統計學意義(

P

<0.05，圖3C)。

圖2 沉默HE4對HT-29細胞HE4蛋白表達的影響

圖3 沉默HE4對HT-29細胞的影響

2.4 沉默HE4對JAK/STAT3通路相關蛋白的影響

si-control組和HE4 si-RNA組JAK1、JAK2、STAT3總蛋白的比較差異無統計學意義。si-control組p-JAK1、p-JAK2和p-STAT3蛋白相對表達量均高于HE4 si-RNA組，差異均有統計學意義(

P

<0.05，圖4)。

圖4 沉默HE4對JAK/STAT3通路相關蛋白的影響

3 討論

結腸癌是全世界面臨的一個嚴峻的健康問題，盡管近年來結腸癌的診治手段有了飛速發展，但是患者的總體生存率仍未明顯提高。尋找結腸癌的新型分子生物學標志具有重要意義。該研究結果顯示，HE4可能成為結腸癌潛在的診治靶點。

HE4位于人染色體20q12-13，約12 kb，由5個外顯子和4個內含子組成。HE4是蛋白酶抑制劑家族成員，廣泛表達于人體各個組織，具有免疫調節作用。近年來HE4在腫瘤中的作用引起了廣泛注意，HE4在卵巢癌、子宮內膜癌、肺癌、泌尿系統移行細胞癌和乳腺癌患者的外周血中高表達，該研究表明，結腸癌患者外周血清中HE4表達水平高于健康人，這與Kemal et al報道一致。另外，該研究Western blot和免疫組織化學染色檢測結果也證實，HE4在結腸癌細胞和組織中高表達。以上提示HE4可能參與了結腸癌的發生，對其早期診斷有重要價值。

HE4與多種腫瘤的進展有關。該研究表明，HE4表達水平與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關，提示HE4可能與結腸癌進展有關。HE4在腫瘤中作用的分子生物學機制既往報道較少。Ribeiro et al研究表明，HE4可以通過調控細胞外基質蛋白(SERPINB2、GREM1、LAMC2和LAMB3)促進卵巢癌細胞的增殖、遷移和黏附。國內周巖 等研究表明，HE4能夠通過影響胞外調節蛋白激酶與蛋白激酶B信號通路促進乳腺癌細胞的增殖并抑制凋亡。

HE4在結腸癌中的作用機制既往鮮有報道。JAK/STAT3是腫瘤的經典通路，可介導增殖、分化、遷移和凋亡，并且與機體免疫調節有關，該通路是結腸癌藥物開發的熱門靶點。既往卵巢癌中的研究表明，HE4可以靶向作用于JAK/STAT3信號通路，敲除HE4可以通過抑制JAK/STAT3信號通路而抑制卵巢癌細胞的增殖和惡性進展。該研究表明沉默HE4后結腸癌HT-29細胞增殖、侵襲力降低，并且凋亡率增加，另外p-JAK1、p-JAK2和p-STAT3蛋白相對表達量下降，提示HE4可能通過JAK/STAT3而發揮作用。