過表達miR-302誘導結腸癌細胞促炎水平升高、線粒體氧化應激并抑制裸鼠成瘤的研究

張小路，杜梅紅，彭銀杰，萬 鑫，張建剛，岳大成，劉 新，王世東

結腸癌(colon cancer，CC)是常見于結腸部位的消化道惡性腫瘤，發病率占胃腸道腫瘤第3位，病死率占所有惡性腫瘤的第5位，復發和轉移是患者死亡的主要原因。因此，尋找治療CC安全有效的方法，具有重要意義。

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一種內源性非編碼RNA分子，長度約為23個堿基的小分子單鏈RNA，對機體的基因表達調控具有重要作用。可作為惡性腫瘤診斷、預后判斷的生物標志物以及臨床治療的重要靶點。Erkul et al的研究表明miR-21在喉癌的診斷方面具有重要作用；Yu et al指出miR-224可抑制PTX3蛋白表達防止宮頸癌的發生。其中，miR-302在腫瘤和炎癥等方面的調控作用也備受關注。該實驗探討過表達miR-302誘導CC細胞SW480對炎癥水平、線粒體氧化應激及裸鼠成瘤的影響，以期為CC的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

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1 材料

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實驗細胞與動物 人CC細胞SW480購自北京中科院腫瘤細胞庫。實驗動物SPF級，無胸腺裸鼠12只，雄性，3周齡，體質量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號:SCXK(京)20170022，腫瘤造模前適應性飼養1周。

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試劑與儀器 RPMI 1640、0.25%胰蛋白酶、青/鏈霉素雙抗、10%胎牛血清均購自美國Gibco公司；miRNA-302引物序列、miR-NC對照質粒、轉染試劑盒、RNA提取試劑盒、BCA蛋白定量檢測試劑盒、PCR試劑盒均購自武漢默沙克生物科技有限公司；丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、白介素(interleukin，IL)-6試劑盒、IL-1β試劑盒、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric ocide synthase,iNOS)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors，TNF)-α試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；4%多聚甲醛固定液PBS緩沖液購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購自上海碧云天生物技術有限公司；Navios流式細胞分析儀購自中國貝克曼庫爾特商貿有限公司；Rt2100c酶標檢測儀購自美國BioTeK伯騰儀器公司。

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2 方法

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細胞培養 將水浴融化后的CC細胞SW480，培養于10%胎牛血清、1%青/鏈霉素溶液的RPMI 1640培養基中，經離心、重懸后轉移至T25培養瓶中，調節培養箱環境為37 ℃、5% CO，細胞鋪滿瓶底80%時，用0.25%胰蛋白酶消化處理，細胞處于對數生長期進行實驗。

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細胞轉染與分組 將細胞CC細胞SW480隨機分成3組，空白對照組(Control組)、陰性對照組(miR-NC組)、過表達組(miR-302 mimic組)。Control組加等體積培養液，其余兩組分別按照miR-NC、miR-302 mimic Lipofecta mine2000試劑盒的操作說明，進行轉染處理，細胞培養48 h后，進行后續實驗。

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qRT-PCR檢測miR-302表達 取1.2.2對數生長期的細胞，經消化、離心、重懸后，將細胞稀釋至5×10個/ml，分別取100 μl，接種于96孔板，即控制每孔5 000個細胞，置培養箱24 h(37 ℃,5% CO)，棄培養液。按照RNA提取試劑盒說明，提取總RNA及miRNA，進行反轉錄(37 ℃，1 h)，配制產物，PCR擴增處理后，以2法計算miR-302的相對表達水平,重復3次。

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ELISA檢測促炎因子水平 對數生長期的細胞，按照1.2.3將細胞進行稀釋處理后，分別按照IL-6、iNOS試劑盒說明進行操作，用酶標儀進行檢測。

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qRT-PCR檢測促炎因子mRNA表達 同1.2.3，根據相應試劑盒說明，分別進行引物設計、總RNA提取、反轉錄、定量PCR，以2法計算IL-1β、TNF-α的相對mRNA表達水平,重復3次。

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流式檢測線粒體膜電位變化 對數生長期的細胞，按照1.2.3將細胞進行稀釋處理后，根據線粒體膜電位檢測試劑盒說明進行操作，加入JC-1熒光探針染液，于37 ℃,5% CO的培養箱中培養20 min，洗去染色液后，用流式細胞儀進行檢測。

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試劑盒檢測氧化應激標記物水平 對數生長期的細胞，按照1.2.3將細胞進行稀釋處理后，分別按照MDA、LDH試劑盒說明進行操作。

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Western blot檢測線粒體損傷相關蛋白表達 對數生長期的細胞，按照1.2.3將細胞進行稀釋處理后，加入裂解液處理30 min，收集細胞，離心15 min(4 ℃，12 000 r/min)，收集上清液。按照BCA試劑盒說明，進行蛋白定量。取樣后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉、洗膜、一抗、二抗處理后，加入顯色劑進行檢測。

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建立裸鼠移植瘤模型 將12只裸鼠隨機分為miR-NC組及 miR-302 mimic組，每組6只。取1.2.2對數生長期的細胞，經消化、離心、重懸后，將細胞稀釋至2×10個/ml，按照文獻方法，分別接種于兩組裸鼠右側距腋下0.5 cm處，每只0.2 ml，5周后處死，剝離腫瘤組織并稱量。

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qRT-PCR檢測miR-302的表達 取各組裸鼠腫瘤組織樣本50 mg，采用勻漿儀充分研磨，離心取上清(12 000 r/min，10 min)，加入100 μl三氯甲烷充分混勻，再次離心，取上清液，加入等體積異丙醇，離心后收集沉淀，再根據試劑盒進行轉錄、反轉錄、定量PCR,以2法計算miR-302的相對表達水平,重復3次。

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免疫組化檢測caspase 3陽性表達 將各組裸鼠腫瘤組織樣本采用多聚甲醛固定，制成組織切片，經脫蠟、水化、HO封閉、抗原修復、封閉、抗體孵育、顯色、復染、脫水、透明、封片等處理后，在顯微鏡下觀察，用免疫組化圖像分析軟件進行統計。

2 結果

2.1 過表達miR-302在SW480細胞中的驗證結果

與Control組相比，miR-NC組miR-302表達差異無統計學意義；與miR-NC組相比，miR-302 mimic組miR-302表達升高(

P

<0.05,圖1)。

圖1 各實驗組對SW480細胞miR-302表達量的影響

2.2 過表達miR-302對SW480細胞促炎因子合成的影響

Control組相比，miR-NC組IL-6、iNOS水平差異無統計學意義，與miR-NC組相比，miR-302 mimic組炎癥因子IL-6、iNOS水平升高(

P

<0.05，圖2A)；與Control組相比，miR-NC組差異無統計學意義，與miR-NC組相比，miR-302 mimic組IL-1β和TNF-α mRNA 表達水平上升(

P

<0.05，圖2B)。實驗表明，miR-302過表達誘導CC細胞促炎水平升高，炎癥反應明顯。

圖2 各實驗組對SW480細胞促炎因子的影響

2.3 過表達miR-302對SW480細胞線粒體膜電位、氧化應激水平的影響

與Control組相比，miR-NC組線粒體膜電位變化及氧化應激標記物水平差異無統計學意義，與miR-NC組相比，miR-302 mimic組紅色熒光細胞向綠色熒光細胞轉變較明顯(圖3A)，綠色熒光細胞百分比增加(

P

<0.05，圖3B)，表明線粒體膜電位下降；與miR-NC組相比，miR-302 mimic組LDH及MDA水平明顯上升(

P

<0.05，圖3C、D)。實驗提示，miR-302過表達誘導CC細胞線粒體膜去極化的效果明顯、氧化應激反應增強，促進線粒體損傷。

圖3 各實驗組對SW480細胞線粒體膜電位變化及氧化應激標記物水平的影響

2.4 過表達miR-302對SW480細胞線粒體損傷的影響

與Control組相比，miR-NC組，線粒體膜損傷相關蛋白表達水平差異無統計學意義，與miR-NC組相比，miR-302 mimic組Bax/Bcl2、Cleaved cas3/cas3表達明顯上升，c-Myc表達明顯降低(

P

<0.05，圖4)。實驗表明，miR-302過表達誘導CC細胞線粒體損傷，與2.3結果吻合。

圖4 各實驗組對SW480細胞線粒體損傷標記物表達量的影響

2.5 過表達miR-302對SW480細胞裸鼠成瘤的影響

與miR-NC組相比，miR-302 mimic組裸鼠腫瘤組織質量明顯降低(

P

<0.05，圖5A、B),miR-302表達明顯升高(

P

<0.05，圖5C),caspase 3陽性表達率明顯升高(

P

<0.05，圖5D、E)。實驗表明，miR-302過表達誘導CC細胞抑制裸鼠腫瘤的生長。

圖5 各實驗組對SW480細胞裸鼠成瘤的影響

3 討論

目前，miRNA在惡性腫瘤的診斷、治療、預后中運用廣泛，其中Wang et al的研究表明通過調控miR-203可以阻止CC細胞的轉移；Yuan et al指出miR-136的過表達抑制CC細胞SW480的增殖和侵襲。因此，miRNA對CC的靶向治療具有良好的潛力。

IL-6、iNOS、IL-1β、TNF-α均是生物體內炎癥反應的敏感指標。其中，iNOS是體內NOS活性氧自由基產生的催化酶，反映體內的炎癥程度。An et al指出miR-106能夠調節TNF-α、IL-1、iNOS水平緩解心臟內皮細胞炎癥的發生；而Chen et al的研究顯示通過誘導炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達干擾口腔癌細胞的增殖。該實驗中miR-302 mimic組IL-6、iNOS水平明顯升高，IL-1β和TNF-α mRNA 表達量明顯上升，與上述研究一致。提示miR-302過表達誘導CC細胞促炎水平升高，炎癥反應明顯，干擾CC細胞正常生長。

MDA是自由基發生過氧化反應的產物，是脂質過氧化程度及膜系統受損程度的體現。LDH是生物體內糖酵解途徑中至關重要的氧化還原酶。當線粒體膜電位不平衡，Bcl-2及Bax的高表達促進膜電位的耗散，導致膜穿透性的改變，線粒體表面發生聚合并形成孔道，使促凋亡因子和細胞色素C釋放入細胞質引發凋亡。Kao et al的研究表明miR-31靶向SIRT3破壞口腔癌細胞的線粒體活性并增加氧化應激；有研究指出通過氧化應激、線粒體膜電位喪失誘導癌細胞凋亡，抑制癌癥疾病發展。該實驗中miR-302 mimic組CC細胞膜電位降低、MDA與LDH水平升高、線粒體損傷相關蛋白表達量變化，與上述研究一致。提示miR-302過表達誘導CC細胞膜電位去極化、誘導氧化應激反應、促進線粒體損傷，破壞CC細胞的生理結構完整，抑制腸癌發展進程。

caspase 3在Caspase級聯反應中發揮凋亡執行作用，活化后通過特異性的裂解底物促進凋亡的發生。王儉 等的研究表明miR-23a通過促進肺癌A549細胞凋亡蛋白caspase 3表達，抑制其腫瘤細胞增殖和擴散的能力；Wu et al的報道表明miR-421通過靶向caspase 3調控BGC-823胃癌細胞的凋亡。該實驗中miR-302 mimic組裸鼠腫瘤組織質量明顯降低，caspase 3陽性表達率明顯升高，與上述研究一致，提示過表達miR-302誘導CC細胞抑制裸鼠腫瘤的生長，促進SW480細胞凋亡。