沙格列汀通過miR-15a-5p/INSR軸緩解糖尿病大鼠胰島素抵抗的機制研究

吳美芬，潘海燕，黃興麗，劉裕曉，武 革

胰島素抵抗是2型糖尿病發病的主要機制，也是引起血脂異常、高血壓、脂肪肝等疾病的重要原因。作為一種新型二肽基肽酶4抑制劑，沙格列汀在調控胰島細胞對于葡萄糖的反應中具有良好效果。陳彥平 等研究表明，循環miR-26a高表達的糖尿病患者對于沙格列汀治療的敏感性更高。胰島素受體(insulin receptor，INSR)作為一種跨膜蛋白，在多種器官中廣泛存在，與胰島素功能的發揮存在重要關聯。研究表明促進INSR表達水平的提高是增強胰島素敏感性的關鍵。有研究表明miR-15a在糖尿病患者后代中表達增強，但是其在糖尿病中具體作用的發揮以及影響機制仍需進一步明確。該研究旨在探討沙格列汀對于2型糖尿病胰島素抵抗的影響并在分子層面探討其具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HEK-293T細胞購自南京科佰生物科技有限公司；沙格列汀購自阿斯利康制藥有限公司；大鼠blood glucose試劑盒購自上海卡邁舒生物科技有限公司；TRIzol試劑盒購自美國英杰生命技術有限公司；TransScript II Green One-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；pmirGLO質粒及雙熒光素酶試劑盒購自美國Promega公司；BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；RIPA裂解液、鏈脲佐菌素及三酰甘油(triglyceride，TG)試劑盒均購自北京索萊寶生物技術有限公司；Lipofectamine 3000試劑盒購自美國賽默飛世爾生物技術有限公司；所有抗體均購自美國ABCAM公司，所有引物由深圳華大基因科技有限公司合成；大鼠血糖和胰島素ELISA試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司；大鼠血壓測量儀購自上海玉研科學儀器有限公司；MQ-2000PT糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c, HbA1c)分析儀購自上海惠中醫療科技有限公司；高/低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒購自長春匯力生物技術有限公司；全自動化學發光儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 胰島素抵抗2型糖尿病(insulin resistance-type 2 diabetes mellitus，IR-T2DM)大鼠模型構建

30只雄性SPF級SD大鼠(10周齡，體質量180～250 g)購自南方模式生物研究中心(上海，中國)。大鼠自由飲水進食且生長條件為12 h的晝夜循環、環境溫度標準為20～22 ℃及濕度在50%左右。經適應性喂養1周后，所有雄鼠被隨機均分為生理鹽水組(

n

=5)和IR-T2DM(

n

=25)。采取鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)聯合高脂飲食誘導IR-T2DM大鼠模型：將STZ溶于0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液配制成5 mg/ml STZ溶液，隨后按35 mg/kg腹腔注射至IR-T2DM組大鼠并給予高脂飼料(豬油28%、蔗糖25%、蛋黃3%及普通飼料59%混勻壓縮)喂養15周。生理鹽水組大鼠則腹腔注射等體積枸櫞酸緩沖液并喂養普通飼料15周(小麥粉18%、玉米粉40%、麩皮18%、豆粉20%、骨粉2%及魚粉2%)。在喂養15周后參照已報道研究測定大鼠收縮壓(systolic blood pressure，SP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DP)、體質量(body weight，BW)、空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、空腹胰島素(fasting insulin, FIN)、HbA1c含量、TG、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇(how-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)并計算HOMA胰島素抵抗指數(insulin resistance index，IRI，IRI=FBG×FIN/22.5)和胰島素敏感指數[insulin sensitivity index，ISI，ISI=1/(FBG×FIN)]，在第17周后，試劑盒測定大鼠不同時間點(3、7、10、14和21 d)FBG各3次，若各時間點FBG均16.7 mmol/L，則說明建模成功，建模周期均在15～17周。

1.3 動物分組及處理

將喂養第15～17周的IR-T2DM組大鼠隨機均分為如下5組，每組5只：陰性對照組(轉染含miRNA陰性對照的脂質體)、miR-15a-5p mimic組(轉染含miR-15a-5p mimic的脂質體)、miR-15a-5p inhibitor組(轉染含miR-15a-5p inhibitor的脂質體)、沙格列汀組(沙格列汀溶液灌胃)和miR-15a-5p inhibitor+沙格列汀組。將購自華大基因的miR-15a-5p mimic和miR-15a-5p inhibitor及陰性對照參照Lipofectamine 3000說明書通過尾靜脈注射的方式轉染至大鼠體內。將沙格列汀溶于生理鹽水中形成2 mg/ml沙格列汀溶液，按12 mg/kg 劑量對大鼠灌胃，每天一次，持續8周(分組處理期間，陰性對照組大鼠死亡1只，miR-15a-5p mimic組大鼠死亡2只)。隨后采用40 mg/kg的1%戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉大鼠，在無菌條件下獲取大鼠股四頭肌和外周血并保存于液氮中。

1.4 靶向INSR的miRNA預測及雙熒光素酶報告系統驗證

以INSR常用轉錄本ENST00000341500為輸入，搜索TargetScan 7.2數據庫(http://www.targetscan.org/vert_72/)中含有Conserved sites的miRNA并選取Pct得分大于0.7的miRNA作為候選miRNA；同時獲取miRDB數據庫(http://www.mirdb.org/)中Target 得分大于80的miRNA；隨后在miRWalk 3.0數據庫(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)中以binding probability>0.95靶向位點在3端非翻譯區域(untranslated coding regions, UTR)的miRNA為閾值獲取候選miRNA。Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制3個數據集的候選miRNA的Venn圖并取交集。設計INSR的野生型及定點突變的3′UTR 片段并交由華大基因合成，隨后分別克隆到含有熒光素酶報告基因pmirGLO上游。挑菌、測序后提純質粒備用。miR-15a-5p mimic和mimic NC(由美國賽默飛世爾合成)分別與野生型及突變型3′UTR片段按Lipofectamine3000說明書兩兩共轉染至HEK-293T細胞。轉染后4 h換液，在37 ℃、CO體積分數為5%的培養箱中培養48 h后，收獲細胞。雙熒光素酶試劑盒和全自動化學發光儀檢測熒光強度。細胞相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.5 反轉錄-PCR和定量-PCR

按TRIzol試劑盒提取骨骼肌和外周血中總RNA。DEPC處理的超純水溶解RNA，使用ND-1000測量260 nm和280 nm下吸光度值，對總RNA的質量進行鑒定及測定濃度。利用TransScript II Green One-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒一步完成RT-PCR合成及Q-PCR。反應體系和反應條件均依據試劑盒說明書進行設置。使用實時熒光定量PCR儀進行擴增，GAPDH和U6 snRNA分別作為基因和miRNA的內參，引物序列見表1。采用溶解曲線評價PCR結果的可靠性，取Ct值(擴增動力曲線拐點)，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內參)，△△Ct=△Ct(實驗組)-△Ct(對照)。

表1 PCR引物

1.6 Western blot實驗

RIPA裂解液使用前5 min加入PMSF，使PMSF終濃度為1 mmol/L。將適當的RIPA裂解液加入骨骼肌組織中(每20 mg組織添加200 μl裂解液)并于冰上孵育5 min。裂解物于26 760 r/min，4 °C下離心5 min。上清液采用BCA試劑盒測定蛋白濃度并用ddHO調整，隨后進行SDS-PAGE凝膠電泳并轉至PVDF膜上。含5% 牛血清蛋白的TBST在搖床上室溫封閉1 h。棄去封閉液，加入一抗INSR、p-IRS-1、GLUT4、GAPDH(所有抗體均按1∶1 000稀釋，終濃度為1 μg/ml)。將PVDF膜轉印面朝上，置于4 ℃冰箱振蕩過夜。次日，用TBST漂洗3×10 min。同法加入稀釋好的山羊抗鼠IgG二抗，4 ℃孵育4～6 h后，用TBST洗膜3次，每次5 min。PVDF膜與ECL液在室溫下反應1 min。吸去液體，覆蓋保鮮膜，拍攝X光片，觀察結果。以目標條帶與內參照條帶的灰度值之比作為蛋白質的相對表達量。

1.7 統計學處理

使用SPSS 21.0軟件包對計量數據進行分析并計算出平均值和標準差。對數據進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，若符合正態分布，則兩組間數據分析使用

t

檢驗且多組間數據的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法。若不符合正態分布，兩組間數據使用Kolmogorov-Smirnov檢驗且多組數據采用Kruskal-Wallis檢驗。等級資料兩兩比較采用秩和檢驗。

P

<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 沙格列汀調控胰島素抵抗的可能分子機制

多種預測工具預測INSR的上游共同miRNA(圖1A)并檢測上述miRNA在沙格列汀處理后IR-T2DM大鼠骨骼肌組織中的表達，結果顯示(圖1B)，與生理鹽水組相比，IR-T2DM大鼠骨骼肌miR-497-5p與miR-15a-5p升高(均

P

<0.05)，但miR-4458、miR-6838-5p水平變化不明顯；IR-T2DM鼠經沙格列汀處理后，miR-4458、miR-6838-5p表達升高(均

P

<0.05)而let-7i-5p表達無明顯變化，但miR-497-5p與miR-15a-5p表達降低(均

P

<0.05)。推測沙格列汀可能通過下調miR-497-5p與miR-15a-5p來促進糖尿病的治療。該研究選擇與2型糖尿病發病及胰島素抵抗的功能研究目前尚未完全明確的miR-15a-5p進行后續研究。隨后雙熒光素酶報告系統進一步驗證了miR-15a-5p和INSR的靶向關系(圖1C、D)(

P

<0.05)。

圖1 沙格列汀調控胰島素抵抗的可能的分子機制

2.2 沙格列汀通過介導miR-15a-5p對IR-T2DM大鼠INSR、IRS-1和GLUT4表達的影響

將IR-T2DM大鼠分別進行陰性對照、miR-15a-5p mimic、miR-15a-5p inhibitor轉染或沙格列汀處理。檢測IR-T2DM大鼠骨骼肌中INSR、IRS-1和GLUT4的mRNA和蛋白表達，結果顯示(圖2)：與陰性對照組相比，IR-T2DM大鼠經miR-15a-5p inhibitor或沙格列汀處理后INSR、IRS-1和GLUT4 mRNA 的蛋白表達及磷酸化IRS-1表達被誘導(均

P

<0.05)；但miR-15a-5p mimic組中上述分子表達下調(均

P

<0.05)。與miR-15a-5p inhibitor或沙格列汀單獨處理相比，兩者聯合處理則有利于升高INSR、IRS-1和GLUT4 mRNA的蛋白及磷酸化IRS-1的表達(均

P

<0.05)。

圖2 INSR、IRS-1和GLUT4在不同處理后的IR-T2DM大鼠骨骼肌中表達

2.3 各組大鼠血清HbA1c、TG、HDL-C和LDL-C表達檢測結果

對各組大鼠血清HbA1c、TG、HDL-C 和LDL-C表達進行檢測，結果表明(表2)：與陰性對照組相比，miR-15a-5p inhibitor組和沙格列汀組IR-T2DM大鼠血清HbA1c、TG和LDL-C水平下調，但HDL-C合成在上述組中升高(均

P

<0.05)。IR-T2DM大鼠轉染miR-15a-5p mimic后相對于陰性對照其HbA1c、TG和LDL-C生成被誘導，但miR-15a-5p mimic組HDL-C濃度降低(均

P

<0.05)。與單獨處理組比較，miR-15a-5p inhibitor聯合沙格列汀能更有效地改善IR-T2DM大鼠血清糖和脂代謝障礙(均

P

<0.05)。因此，沙格列汀能通過介導miR-15a-5p有效調節IR-T2DM大鼠糖和脂代謝。

表2 HbA1c、TG、HDL-C 和LDL-C在不同處理后IR-T2DM大鼠血清中濃度

2.4 沙格列汀通過介導miR-15a-5p對IR-T2DM大鼠的胰島素敏感性的影響

為檢測miR-15a-5p或沙格列汀對IR-T2DM大鼠IRI和ISI的影響。IR-T2DM大鼠分別進行miR-15a-5p mimic、miR-15a-5p inhibitor或沙格列汀處理。之后測定其SP、BW、FBG和FINS并計算IRI和ISI。結果顯示(圖3)：與陰性對照組相比，miR-15a-5p inhibitor組和沙格列汀組IR-T2DM大鼠ISI升高，同時該組SP、DP和IRI較為下降(均

P

<0.05)；此外，SP、DP和IRI的值在miR-15a-5p mimic組IR-T2DM大鼠中明顯升高并伴隨著ISI的下降(均

P

<0.05)。另外，與同時期陰性對照組相比，miR-15a-5p inhibitor和沙格列汀組IR-T2DM大鼠體質量在第4周和第8周增加，而miR-15a-5p mimic組在第2、4和8周體質量均下降(均

P

<0.05)。聯合組較單獨處理組而言能更明顯地增強IR-T2DM大鼠的胰島素敏感性指標(均

P

<0.05)。基于上述結果，沙格列汀可能通過介導miR-15a-5p增強IR-T2DM大鼠的胰島素敏感性，從而促進機體對葡萄糖的利用。

圖3 不同處理后IR-T2DM大鼠胰島素敏感性指標、血壓及體質量

3 討論

該研究通過生物信息學以及實驗手段選定miR-15a-5p進行研究，結果顯示沙格列汀能夠通過調控miR-15a-5p的表達進而影響INSR，增強IR-T2DM大鼠胰島素敏感性、改善胰島素抵抗的情況。

既往的研究表明沙格列汀可以通過增加細胞胰島素敏感性，從而激活INSR級聯信號來促進機體對葡萄糖的利用率。近年來沙格列汀在糖尿病治療中的潛在的分子機制不斷被明確，如張政軍 等研究表明沙格列汀能夠通過調節miR-590/TLR4/NF-κB信號通路進而改善血管內皮細胞損傷。此外，也有研究表明，SDF-1α介導了沙格列汀對胰島β細胞增殖的保護作用。陳彥平 等認為高表達miR-26a的糖尿病伴非酒精性脂肪肝患者在沙格列汀治療中能夠取得更好的效果。該研究對篩選得到的交集靶miRNA在生理鹽水組大鼠、IR-T2DM以及沙格列汀治療組大鼠中的表達進行檢測發現，相對于生理鹽水組、T2DM組miR-497-5p和miR-15a-5p表達增強，而接受沙格列汀處理后上述因子表達被抑制。推測沙格列汀可能通過下調miR-497-5p與miR-15a-5p來促進糖尿病的治療。多項研究表明miR-497-5p能靶向INSR進而影響糖尿病大鼠胰島素抵抗和耐藥性機制。另外Wang et al研究表明上調miR-497-5p能通過靶向INSR誘導E3大鼠的肝胰島素抵抗機制。除了Houshmand et al研究表明miR-15a在糖尿病患者后代中表達升高，并沒有關于miR-15a和2型糖尿病具體發病機制關系的相關研究，因此，該研究關注miR-15a對胰島素抵抗功能的影響。但也有研究表明，miR-15a在糖尿病患者外周血中表達降低并且可作為糖尿病診斷的潛在標志物。這一發現與該研究的結果趨勢相反，推測miR-15a可能由于組織差異性的表達從而在不同組織中發揮不同功能。此外，IR-T2DM大鼠在接受沙格列汀處理后miR-15a-5p表達被抑制，且miR-15a-5p與INSR的靶向關系被隨后驗證，即沙格列汀可能通過調控miR-15a-5p介導INSR進而參與IR-T2DM的治療。

IRS1為INSR底物家族的一員并且被證實是引起T2DM發病的重要因子，該基因缺失的大鼠表現為胰島素抵抗。GLUT4是人體內主要的葡萄糖轉運載體，在心肌、骨骼肌以及脂肪細胞等多種對胰島素敏感的細胞中表達，其能夠在胰島素的刺激下轉運至細胞膜并促進葡萄糖儲存于上述組織和細胞中，多種針對T2DM治療的藥物均能夠通過促進GLUT4的表達進而增強胰島素敏感性。該課題組通過研究表明T2DM大鼠在接受miR-15a-5p inhibitor或沙格列汀處理后其骨骼肌中INSR和GLUT4表達增強且二者聯合作用效果更明顯，表明沙格列汀通過調控miR-15a-5p的表達進而促進T2DM的改善。此外，沙格列汀還能夠調節miR-15a-5p促進IR-T2DM大鼠血清糖和脂代謝相關指標的改善。對各組大鼠血壓相關指標以及IRI和ISI等指標進行檢測，沙格列汀治療或抑制miR-15a-5p的表達能夠改善大鼠血壓相關指標，降低IRI并促進胰島素敏感的改善。另外，該研究還對各組大鼠的體質量進行了測量，結果顯示沙格列汀組和miR-15a-5p inhibitor組大鼠體質量在第4周和第8周增加，而miR-15a-5p mimic組大鼠體質量則下降。miR-15a-5p inhibitor、沙格列汀組和聯合組大鼠在第2周體質量變化較陰性對照組不明顯，推測可能有增加的趨勢，且

P

值接近顯著性的閾值，可能是由于樣本量較小而導致差異不明顯。