miR-513a-3p在結腸癌中高表達并誘導細胞生長和遷移的機制研究

繆作華，劉素云，李 丹

結腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球第三大常見癌癥，也是常見的癌癥相關死因之一。既往研究表明，腫瘤抑制基因的失活和致癌基因的激活均有可能導致CRC發病，這些功能基因被很多分子調控，比如多種MicroRNAs(miRNAs)在CRC發病中發揮著重要的作用。miRNAs是一種長度在19～24個核苷酸之間小型的非編碼RNA，通過與靶蛋白mRNA3′端非編碼區(3′-UTR)結合，導致靶蛋白翻譯抑制，靶蛋白可影響細胞的生物學作用，因而miRNAs在細胞生長、增殖、凋亡和分化等多種生物學過程中發揮著重要作用。miR-513a-3p作為miRNAs中一員，被證實介導了多種腫瘤增殖。關于CRC與miR-513a-3p相關報道較為少見，其作用機制也尚未明確。因此，該研究通過觀察CRC患者癌組織與肺癌組織miR-513a-3p的差異，證實CRC發病與miR-513a-3p異常表達的關系，再用人CRC細胞株HT-29和SW480細胞進行體外實驗，初步探究miR-513a-3p對CRC細胞生長和遷移的誘導機制。

1 材料與方法

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1 病例資料

收集2018年10月—2019年4月在該院確診為CRC患者的CRC組織及癌旁正常組織30例作為研究對象，男女比例為17∶13，年齡為(58.32±12.47)歲。入選條件：術前未接受放射性治療、化療或者藥物治療。手術切除CRC變組織和臨近非癌變組織，各選取1～2 cm漂洗干凈后放置于4%多聚甲醛中固定，其余部分液氮中速凍留用。實驗中所涉及的患者均經本人或家屬同意，并簽署知情同意書，且經醫院倫理委員會審核后實行研究。

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2 試劑與儀器

人CRC細胞株HT-29(HTB-38)和SW480(cl-228)購自美國菌種保藏中心ATCC；miR-454-3p探針由上海吉瑪制藥技術有限公司構建；10%胎牛血清購自上海前塵生物科技有限公司；胃蛋白酶購自深圳市文樂生物科技有限公司；NTE緩沖液購自北京沃凱生物科技有限公司；SCS緩沖購自液深圳市文樂生物科技有限公司；地高辛抗體購自北京拜爾迪生物技術有限公司；DAB顯色劑購自北京綠源大德生物科技有限公司；TRIzol試劑盒購自北京中成謹念科技有限公司；反轉錄試劑盒購自武漢科爾普生物科技有限公司；SYBR Green PCR 混合試劑盒購自成都柏諾科技有限公司。

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3 實驗方法

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細胞培養 培養在含10%胎牛血清(FBS, Gibco，10099141)和1%雙抗(Gibico，1566407)的DMEM(Hyclone, 8118174)高糖完全培養基中，放置于37 ℃，5% CO培養箱內培養，每2～3 d傳代并更換培養液。

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miR-513a-3p表達的檢測 ① 原位雜交檢測miR-513a-3p在組織中的表達水平。將組織從4%多聚甲醛中拿出，進行常規脫水、浸蠟和石蠟包埋后，6 μm切片，二甲苯脫蠟處理，然后用高濃度到低濃度的乙醇水化，放入30%過氧化氫和蒸餾水1∶10 混合液中(25 ℃，5～10 min)滅活內源性酶，滴加3%枸櫞酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37 ℃消化15 min，1%多聚甲醛/0.1 mol/L的PBS，含有1/1 000 DEPC，室溫后固定10 min，洗凈后42 ℃預雜交2～4 h，隨后滴加30 μl 探針雜交液。42 ℃ 濕盒孵育過夜，SSC振蕩漂洗、NTE緩沖液漂洗。37 ℃封閉30 min，滴加地高辛抗體37 ℃封閉60～120 min，隨后SABC、生物素化過氧化物酶分別處理，DAB顯色，顯色后沖洗，乙醇脫水，透明后封片。② miR-513a-3p相對表達水平的檢測。取凍存的組織(或者細胞)標本，嚴格按照TRIzol試劑盒的說明書提取組織中總RNA，再根據反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA，最后把其作為模板通過qRT-PCR檢測miR-513a-3p的表達水平，上海生工生物工程(上海)股份有限公司協助完成引物設計和合成，嚴格按照SYBR Green PCR 混合試劑盒操作要求進行定量操作。miR-513a-3p正向和反向引物分別是5′-TAAATTTCACCTTTCTGAGAAGG-3′和5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；U6作為內參，它的正向和反向引物分別為5′-CTCGCTTCGGCAGCAA-3′和5′-AACGCTTCACGATTTGCGT-3′。使用2法進行定量計算，實驗重復3次。

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人CRC細胞株HT-29和SW480細胞轉染miR-513a-3p 將細胞株分別接種于96孔板中，37 ℃，5% CO培養箱內培養24 h，細胞密度達到50%～70%時參照Lipofectamine 2000 試劑(Invitrogen)說明書將miR-513a-3p 模擬物(miR-513a-3p mimics)(促進表達組)及陰性對照(miR-513a-3p NC)(陰性對照組)轉染于細胞株。

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MTT法檢測轉染miR-513a-3p后細胞的活力 將轉染后的細胞接種于96孔板中，培養箱中分別培養1、2、3、4 d后，倒去舊的培養基，各孔加入基礎培養基稀釋好的MTT，使得最終每孔MTT終濃度為0.5 mg/ml，100 μl每孔，相同條件下繼續培養4 h。最后倒去舊培養基，每孔加入150 μl的DMSO。置于酶標儀中中速振蕩10 min，以加速結晶溶解，在490 nm處測定吸光度值。

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細胞克隆實驗觀察轉染miR-513a-3p后細胞的增殖能力 將轉染后的細胞消化充分并吹打至單個細胞，然后接種到鋪好瓊脂糖及細胞培養液的6孔板中(細胞200個/孔)，培養箱中培養7 d后，4%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS洗2～3遍后0.1%結晶紫溶液染色15 min，鏡下觀察細胞集落(細胞數量>20個)的數目。

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細胞劃痕實驗觀察轉染miR-513a-3p后細胞的遷移能力 種板前用標記筆在6孔板外側底部，用直尺均勻地畫4條直線；細胞5×10個/孔接種于6孔板，貼壁長滿后，倒掉培養液，用200 μl移液槍頭在底部中央作一直線劃痕，PBS洗3次去除細胞表面殘骸和碎片，分別在培養0、12、24 h后觀察細胞遷移情況，并拍照記錄。每孔沿劃痕從上到下觀察6個視野，每組3個復孔共18個視野。

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Transwell實驗檢測轉染miR-513a-3p細胞的侵襲能力 細胞饑餓24 h后充分消化，接種到transwell小室(稀釋的Matrigel基質膠包被)基底膜的上室表面，接種密度1×10個/室，下層小室內為10%含血清完全培養基，37 ℃培養24 h后, 4%多聚甲醛固定后0.1%結晶紫染色細胞，顯微鏡下選5個視野計數穿出細胞數目。

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NF-κB和Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達的檢測 提取HT-29和SW480細胞中的蛋白，隨后用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度，樣品定量后上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(SDS-PAGE)凝膠，然后按照“三明治”標準進行轉膜，300 mA恒流60 min，封閉后分別于4 ℃孵育p-p65(ab16502)、p65(ab86299)、p-IκBα(ab92700)、IκBα(ab32518)、Wnt3a(ab28472)、Wnt5a(ab72583)、β-catenin(ab32572)和β-actin(ab8226)一抗4 ℃孵育過夜，二抗(CST，#7076)室溫孵育1 h，最后使用化學發光儀曝光，所得條帶的蛋白灰度值采用Image-J進行分析，按目的蛋白/內參相對灰度值作為分析結果。

2 結果

2.1 組織中miR-513a-3p的表達

原位雜交檢測結果顯示(圖1A)，CRC組織miR-513a-3p陽性表達(棕色區域)較癌旁組織增加。qRT-PCR檢測結果顯示(圖1B)，CRC組織miR-513a-3p相對表達量較癌旁組織升高(

t

=12.357，

P

<0.01)。

圖1 CRC組織中miR-513a-3p的表達

2.2 miR-513a-3p過表達促進細胞增殖能力

促進表達組的HT-29和SW480細胞miR-513a-3p相對表達量均高于陰性對照組(

t

=16.371、13.579；均

P

<0.01)，提示miR-513a-3p在HT-29和SW480細胞中轉染成功(圖2A)。陰性對照組和促進表達組的HT-29細胞活力在1、2、3、4 d時間中逐漸升高(

F

=8.761、21.459；均

P

<0.01；圖2B)，陰性對照組和促進表達組的SW480細胞活力在1、2、3、4 d時間中亦逐漸升高(

F

=8.136、18.673；均

P

<0.01；圖2C)。與陰性對照組比較，促進表達組細胞活力在3、4 d兩個時間段中均升高(

t

=9.962、12.918；均

P

<0.01)。

圖2 miR-513a-3p過表達促進細胞增殖能力

2.3 miR-513a-3p過表達對細胞遷移能力的影響

與陰性對照組比較，促進表達組的HT-29和SW480細胞侵襲細胞比例增加(

t

=43.675、36.782；均

P

<0.01；圖3A、B)。促進表達組HT-29和SW480的細胞遷移能力增強，劃痕面積愈合快(圖3C)。

圖3 miR-513a-3p過表達對細胞遷移能力的影響

2.4 miR-513a-3p過表達對NF-κB和Wnt/β-catenin通路的影響

Western blot結果如圖4所示，與陰性對照組比較，促進表達組的HT-29細胞p-p65和p-IκBα、Wnt3a、Wnt5a和β-catenin蛋白相對表達量均升高(

t

=14.719、14.878、8.957、9.137、9.132；均

P

<0.01)，促進表達組的SW480細胞p-p65和p-IκBα、Wnt3a、Wnt5a和β-catenin蛋白相對表達量均升高(

t

=15.134、15.579、5.362、6.964、10.950；均

P

<0.05)，提示miR-513a-3p過表達兩種細胞的p65/p-IκBα通路、Wnt/β-catenin通路均被激活。

圖4 miR-513a-3p過表達對NF-κB和Wnt/β-catenin通路的影響

3 討論

全球每年有100多萬CRC新確診病例，CRC不僅加重社會和家庭經濟負擔，且嚴重威脅到患者的生命健康。CRC早期臨床癥狀并不明顯，部分CRC患者確診時已發展到中晚期，這給予臨床治療帶來巨大的挑戰。另一方面，隨著醫療技術不斷進步，以手術、化療和放射治療等治療手段為主治療CRC，雖然有效改善CRC患者的生存和預后情況，但患者病死率依舊居高不下，每年仍有約60.8萬人死亡。因此，開展CRC相關研究探討其分子引起的發病機制，以期為CRC尋求治療藥物或治療靶點具有重要的意義。該研究旨在觀察miR-513a-3p在CRC組織及癌旁正常組織表達差異，初步探究miR-513a-3p與CRC發病機制的關系。

既往研究表明miRNAs參與介入幾乎所有類型的癌癥和惡性腫瘤，而CRC患者中或CRC組織中也有多種miRNAs異常表達。多項研究中表明miR-513a-3p充當“癌基因”的角色，其高表達能促進癌癥發生發展，與上述結果相似，該研究應用原位雜交和qRT-PCR檢測CRC組織和癌旁正常組織的miR-513a-3p表達情況，結果顯示CRC組織miR-513a-3p均高于癌旁組織，提示miR-513a-3p過表達可能增加CRC發生風險。癌癥易擴散、易復發歸因于癌細胞增殖快、遷移侵襲能力強等惡性特征，基于以上結果可以推測，miR-513a-3p過表達可能通過影響癌細胞增殖、遷移、侵襲等惡性特征參與CRC發病機制，為了驗證以上推論，該研究利用兩種不同來源的癌細胞株轉染miR-513a-3p類似物，以達到miR-513a-3p過表達的目的，結果顯示，促進表達組miR-513a-3p相對表達量明顯高于陰性對照組，表明實驗轉染成功。進一步檢查細胞活力、遷移能力和侵襲能力顯示，促進表達組細胞活力增高，遷移和侵襲能力明顯增強，結果提示過表達的miR-513a-3p能夠促進癌細胞增殖、遷移和侵襲作用。

上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)賦予細胞遷移和侵襲性，EMT參與CRC的遷移進程，而Wnt/β-catenin信號通路參與調控EMT的過程，Wnt/β-catenin信號途徑被激活時，E-cadherin/catenin 復合物穩定性遭到破壞而發生一系列生物學作用，最終會導致EMT的發生。該研究采用Western blot檢測兩種癌細胞Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白顯示，促進表達組Wnt3a、Wnt5a和β-catenin蛋白相對表達量均較陰性對照組升高，提示Wnt/β-catenin信號通路活化，過表達的miR-513a-3p可能通過調控Wnt/β-catenin信號通路表達促進癌細胞遷移和侵襲作用。研究顯示NF-κB信號通路在抑制CRC細胞增殖中也扮演重要的角色。該研究結果顯示，促進表達組Wnt3a、Wnt5a和β-catenin蛋白相對表達量均升高，促進表達組p-p65和p-IκBα蛋白相對表達量均較陰性對照組升高，提示NF-κB信號通路活化，過表達的miR-513a-3p可能通過調控NF-κB信號通路表達促進癌細胞增殖作用。

綜上所述，miR-513a-3p在CRC組織中的表達升高，細胞實驗證實過表達的miR-513a-3p能促進人CRC細胞株HT-29和SW480的生長和遷移，其作用機制可能與NF-κB和Wnt/β-catenin通路的激活相關。