CD98基因沉默對黑色素瘤B16-F10細胞增殖、凋亡及PI3K/AKT通路的影響

劉 靜，李東寧，張曉嵐，廖久棋，程茜南

黑色素瘤是已知的最惡性的皮膚癌，由正常黑色素細胞惡性轉化形成，在過去的幾十年中，其全球發病率穩步上升，病死率極高。如果早期診斷和治療，黑色素瘤可以治愈，但是，轉移性黑色素瘤很難治療，大多數晚期黑素瘤對放療和化療反應不良，目前尚無有效的方法抑制該癌的轉移擴散。轉移性惡性黑色素瘤患者中位生存期約7.5個月，5年生存率約為5%。因此，探討黑色素瘤轉移的機制對改善黑色素瘤患者預后具有重要意義。

CD98是一種異二聚體跨膜糖蛋白，由重鏈和輕鏈組成，在人體內除血小板外各組織廣泛分布。CD98在腫瘤細胞等增殖活躍細胞上過度表達，與腫瘤細胞的增殖和腫瘤的發生發展過程密切相關。已有研究表明，CD98在黑色素瘤中高表達，可作為黑色素瘤的生物標志物。但關于CD98對黑色素瘤的具體作用機制并不明確，該研究旨在探究CD98基因沉默對黑色素瘤B16-F10細胞增殖、凋亡及PI3K/AKT通路的影響。

1 材料與方法

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1 主要試劑

DMEM培養基(10569-010)、胎牛血清(10099-141)、胰蛋白酶(15050-057)和青-鏈霉素(15140-122)均購自美國賽默飛世爾科技公司；皮膚黑色素瘤細胞B16-F10購自國家模式與特色實驗細胞資源庫；Transwell(K914-100)購自武漢艾美捷科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(A0208)和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062L)均購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗單克隆抗體Ki67(ab15580)、Bax(ab104156)、Bcl-2(ab59348)、Caspase-3(ab13847)、cleaved Caspase-3(ab2302)、PI3K(ab191606)、p-PI3K(ab182651)、AKT(ab106693)、p-AKT(ab192623)和GAPDH(ab9485)均購自英國Abcam公司。

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2 細胞培養

將B16-F10細胞培養于37 ℃，5% CO恒溫培養箱中用高糖DMEM培養基(含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素)培養，每3 d更換1次培養基，收集細胞時用0.25%胰蛋白酶消化，選用對數生長期細胞為試驗用細胞。

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3 細胞處理及分組

設計3條不同的shRNA序列干擾片段(shRNA1、shRNA2、shRNA3)轉染至B16-F10干擾CD98表達。通過RT-PCR實驗選擇最佳干擾序列shRNA3進行后續實驗。細胞隨機分為3組：Control組、shRNA-NC組、CD98-shRNA3組。Control組不作處理，shRNA-NC組轉染空質粒，CD98-shRNA3組轉染shRNA3。

1.4 RT-PCR

用TRIzol法從各組B16-F10細胞中提取總RNA，培養于37 ℃，5% CO恒溫培養箱中，使用FastKing RT試劑盒通過標準反應進行mRNA的逆轉錄，使用Fast qPCR Mix進行實時PCR，反應條件為：95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，55 ℃、30 s，72 ℃、15 s。以GAPDH為內參，用2方法計算。

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5 克隆形成實驗

將B16-F10細胞接種至6孔板，每孔約500個細胞，按方法1.3進行分組，培養7 d后棄掉上清液，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色15 min，洗凈干燥后于顯微鏡下觀察克隆形成數目，計算克隆形成率。細胞克隆形成率(%)=細胞克隆總數/接種細胞數×100%。

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6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數生長期細胞B16-F10接種于6孔板，按方法1.3分組處理，胰酶消化吸收后，PBS洗滌2次，加入500 μl緩沖液懸浮細胞，再加入5 μl磷脂酰絲氨酸蛋白混勻，最后加入碘化丙啶10 μl室溫避光反應20 min通過流式細胞儀檢測各組細胞凋亡。

1.7 Transwell實驗

取無血清培養基稀釋的人工基底膜，加入Transwell上室，37 ℃風干。取對數生長期的B16-F10細胞，按方法1.5處理分組。上室中加入200 μl的細胞懸液，下室中加500 μl的含血清的DMEM培養基。37 ℃、5% CO下培養24 h，棉簽擦去基質膠和上室細胞，多聚甲醛固定后染色。光學顯微鏡下計數并拍照，每個樣本隨機選取5個視野。

1.8 Wsetern blot實驗

各組細胞加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白轉移至PVDF膜。4 ℃下加入CD98、Ki67、PCNA、Bax、Bcl-2、Caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT一抗(1∶1 000)孵育過夜，TBST清洗后加入HRP-IgG(1∶10 000)，加入電化學發光顯色液顯色。以GAPDH為內參，ImageJ V1.8.0.112軟件分析各組細胞目的蛋白與GAPDH比值。統計灰度值，目的條帶相對表達量以目的蛋白與GAPDH灰度值比值表示。

2 結果

2.1 CD98表達水平

與Control組比較，3個CD98 shRNA 的CD98 mRNA水平均降低(

F

=227.5，

P

<0.05)，選擇CD98-shRNA3進行后續實驗；與Control組比較，CD98-shRNA3組CD98蛋白表達水平降低(

t

=1.837，

P

<0.05)。見圖1。

圖1 CD98 mRNA水平和蛋白表達水平

2.2 沉默CD98對B16-F10細胞增殖的影響

與Control組比較，CD98-shRNA3組克隆形成率降低(

t

=1.622，

P

<0.05)。見圖2。

圖2 沉默CD98對B16-F10細胞增殖的影響 ×200

2.3 沉默CD98對B16-F10細胞Ki67、PCNA蛋白表達水平的影響

與Control組比較，CD98-shRNA3組Ki67、PCNA蛋白表達降低(

t

=1.113、1.286，

P

<0.05)。見圖3。

圖3 沉默CD98對B16-F10細胞增殖蛋白的影響

2.4 沉默CD98對B16-F10細胞凋亡的影響

與Control組比較，CD98-shRNA3組細胞凋亡率升高(

t

=1.147，

P

<0.05)。見圖4。

圖4 沉默CD98對B16-F10細胞凋亡的影響

2.5 沉默CD98對B16-F10細胞Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3值的影響

與Control組比較，CD98-shRNA3組Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高(

t

=1.002、1.933，

P

<0.05)。見圖5。

圖5 沉默CD98對B16-F10細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平的影響

2.6 沉默CD98對B16-F10細胞侵襲的影響

與Control組比較，CD98-shRNA3組侵襲細胞數降低(

t

=1.533，

P

<0.05)。見圖6。

圖6 沉默CD98對B16-F10細胞侵襲的影響 ×200

2.7 沉默CD98對B16-F10細胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值的影響

與Control組比較，CD98-shRNA3組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT值降低(

t

=1.105、1.176，

P

<0.05)。見圖7。

圖7 沉默CD98對B16-F10細胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達水平的影響

3 討論

盡管總體癌癥發病率正在下降，但黑色素瘤的發病率仍繼續以每年約3%的速度增長，黑色素瘤是一個嚴重的公共衛生問題，帶來了沉重的經濟負擔。CD98通過其重鏈CD98hc與整合素相互作用，調控細胞增殖、存活、遷徙、上皮細胞黏附性及極向，在喉部鱗狀細胞癌、肺腺癌、乳腺癌及腎細胞癌等惡性腫瘤中高表達。

該研究表明，沉默CD98可降低B16-F10細胞克隆形成率和Ki67、PCNA蛋白表達水平。在黑色素細胞向黑色素瘤細胞轉變過程中，黑色素細胞增殖異常，其增殖能力決定著黑色素瘤的進展和預后。Ki67是增殖細胞核中的非組蛋白性核蛋白，在細胞周期中可識別細胞核抗原，其表達水平的高低可以指示黑色素瘤細胞增殖的變化。PCNA是一種與細胞增殖狀態相關的核蛋白，其表達水平隨著臨床分期和淋巴節轉移的增加逐漸升高，可指示細胞增殖和所處周期。相關研究表明，通過使用CD98抑制劑在體內和體外均可抑制細胞增殖和腫瘤生長。提示沉默CD98可抑制B16-F10細胞增殖。

癌細胞凋亡降低是黑色素瘤重要的生物學特征，調控細胞凋亡是治療黑色素瘤的必要方式。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2可相互作用，其形成的復合物比值的高低可判定細胞凋亡狀態。Caspase家族處于細胞凋亡過程中的核心地位，可通過與多種蛋白因子相互作用調節細胞凋亡，其中Caspase-3在凋亡級聯中過度活化能夠促進細胞凋亡。該研究表明，沉默CD98升高B16-F10細胞凋亡率和Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3值的作用。提示沉默CD98誘導B16-F10細胞凋亡。

侵襲和轉移是影響黑色素瘤生存的首要因素也是治療的最大障礙。賈國戰 等研究表明CD98通過增強人類肝癌細胞的黏附及遷徙能力，促進肝癌的侵襲和轉移。張磊 等研究表明CD98可能通過上調CD147的表達來調控結直腸癌的侵襲轉移。該研究表明，沉默CD98具有抑制B16-F10細胞侵襲的作用。

PI3K/AKT信號通路與腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病等的發生發展密切相關，其可被多種細胞因子激活，調節細胞增殖、分化、翻譯及轉錄等基本功能。相關研究表明，大多數黑色素瘤中存在AKT的異常活化，異常活化的PI3K/AKT信號通路能增加惡性黑色素瘤細胞的運動能力，促進了黑色細胞轉移和侵襲。該研究表明，沉默CD98具有降低B16-F10細胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值的作用。