沉默APE-1對肝癌細胞Hep 3B轉錄組表達譜及TNF信號通路的影響

孫志鵬，許光中，阿民布和，樊 慶，彭吉潤，張能維

在全球范圍內，肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的發病率、病死率一直居高不下。中國腫瘤登記中心最新公布的癌癥統計數據顯示：2015年新發惡性腫瘤約429萬例，死亡人數約281萬；其中肝癌新發病例約46.61萬，死亡人數約42.21萬例。HCC的發生、進展和轉移是多種遺傳，表觀遺傳和信號通路的失調，與腫瘤微環境相互作用的綜合作用結果。脫嘌呤脫嘧啶核酸內切酶-1(apurinic-apyrimidinic endonuclease 1，APE-1)是一種可以發揮DNA修復功能和氧化還原功能的蛋白，可調節腫瘤相關途徑的多種轉錄因子。前期研究表明，APE-1在肝癌組織和細胞中高表達，且其高表達與TNM分期、組織病理分級存在差異。沉默APE-1表達可降低肝癌細胞Hep 3B的增殖活性，提高細胞凋亡率。該研究旨在研究沉默APE-1對肝癌細胞Hep 3B轉錄組表達譜及TNF信號通路的影響。

1 材料與方法

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1 材料

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組織樣本及實驗細胞 選取2017—2018年在首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院(北京大學第九臨床醫學院)，胃腸肝膽腫瘤外科行肝細胞肝癌手術患者，共計10例，取肝癌組織(非壞死區腫瘤組織)及癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm肝硬化組織約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm)。所有新鮮組織獲取后立即轉入液氮保存。沉默APE-1表達的肝癌Hep 3B穩定細胞株及其對照由實驗室構建后保存。

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主要試劑 總RNA抽提試劑TRIzol、反轉錄RT-PCR Kit試劑盒、mRNA SYBR Green熒光定量PCR試劑購自美國Thermo Scientific公司；SP-0023-SP免疫組化檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；TNFAIP3(ab92324，免疫組化稀釋比例1∶100)和MAP2K6(ab200831，免疫組化稀釋比例1∶100)抗體購自英國Abcam公司。

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2 方法

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轉錄組高通量測序 針對實驗組APE-1沉默表達的Hep 3B細胞，對照組轉染空白質粒的Hep 3B細胞，提取總RNA，檢測合格后反轉錄，構建cDNA文庫。基于Illumina Hiseq 2500進行上機測序，獲取轉錄組測序數據后，進行生物信息學分析。轉錄組高通量測序及分析由華大基因科技有限公司代做。

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RT-PCR檢測TNFAIP3、MAP2K6基因在細胞中表達變化 收集2組穩轉細胞，TRIzol法提取總RNA，按逆轉錄試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按熒光定量PCR試劑盒說明進行PCR擴增。TNFAIP3引物序列為：上游引物5′-CTGCCAGCGAGCGAGC-3′，下游引物5′-TGCTCTCCAACACCTCTCC-3′；MAP2K6引物序列為：上游引物5′-CAAAACTAGCTACAGAAGAGAAGCA-3′，下游引物5′-TTCGCTTCTTGCCTTTCGAC-3′；GAPDH引物序列為：上游引物5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3′，下游引物5′-TCCTGGAAGATGGTGATGGG-3′。PCR反應體系共25 μl：SYBR Premix Ex Taq 12.5 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板2 μl，ddHO 8.5 μl；反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個循環。以GAPDH為內參，采用2法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

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免疫組化檢測TNFAIP3、MAP2K6在肝癌/癌旁組織中表達 組織經過切片、水化、抗原修復，分別滴加一抗和二抗，DAB顯色，中性樹膠封片。光學顯微鏡拍照，采用IPP軟件對圖片進行積分光密度(integrated option density，IOD)。

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基因表達相關性分析 基于TCGA數據庫中374例肝癌患者數據，通過starbase 軟件(http://starbase.sysu.edu.cn/panGeneCoExp.php)分析APE-1和TNFAIP3，APE-1和MAP2K6表達相關性。

2 結果

2.1 沉默APE-1后對肝癌細胞Hep 3B基因表達譜變化的影響

基于差異分析結果，篩選FDR<0.05且|logFC|>1的基因為差異基因，共獲得123個差異基因。其中，沉默APE-1后，肝癌細胞Hep 3B中84個基因表達上調，39個基因表達下調見圖1A。差異比較火山圖、熱圖見圖1B、C。差異變化前10位的基因為APE-1、CEMIP、MAP2K6、TAF11L11、CNGB1、COL5A3、OTULINL、DNAJC12、FOLR1、ACKR3。

圖1 沉默APE-1后導致肝癌細胞Hep 3B基因表達譜變化

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2 差異基因的功能富集分析

GO富集分析結果表明，沉默APE-1后差異表達基因主要參與的分子功能包括蛋白質標簽、結構分子活性、化學驅除活性、運輸活動、翻譯調節器活動、催化活性、電子載體活性、蛋白質結合、分子功能調節、分子轉換活性、轉錄因子活性、核酸結合轉錄因子活性、信號傳感器活動等；參與的細胞組分包括突觸、細胞連接、細胞外基質成分、膜、細胞外區域部分、細胞器、超分子纖維、大分子復合物、膜封閉腔等，參與的生物過程包括發育過程、信號傳導、生物調節、分子定位、細胞成分的組織或生物發生、突觸傳遞中涉及的突觸前過程、生物黏附、對刺激的反應、代謝過程、生殖過程、生物過程的負調控、運動、免疫系統過程、微生物過程等。見圖2。KEGG富集分析結果表明，沉默APE-1后差異表達基因主要參與的信號通路包括TNF信號通路、肌萎縮性側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, LS)、突觸小泡循環、近端小管碳酸氫鹽回收、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝、新霉素、卡那霉素和慶大霉素的生物合成、碳水化合物的消化吸收、癌癥中的轉錄失調、內分泌和其他因子調節的鈣重吸收、精氨酸和脯氨酸代謝、N-聚糖生物合成等，見圖3A。疾病本體(disease ontology, DO)富集分析結果表明，沉默APE-1后差異表達基因主要參與的疾病包括乳腺良性腫瘤、胸良性腫瘤、乳腺囊腫、嬰兒猝死綜合癥、卵巢透明細胞腺癌、卵巢腺癌、胃腺癌、肌萎縮性側索硬化非典型抑郁癥等，見圖3B。

圖2 差異基因的GO功能富集分析

圖3 差異基因的KEGG、DO功能富集分析

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3 互作網絡分析

差異基因蛋白互作網絡的分析結果表明，APE-1和EGR1、MYH14、PRKAR2B、BSN、AC118754.1、UBC、LGSN、IGFBP3、HMGA2等基因組成核心蛋白互作網絡，見圖4。

圖4 差異基因互作網絡分析

2.4 TNF信號通路表達差異

在實驗組和對照組細胞中檢測基因表達，結果表明TNFAIP3、MAP2K6在沉默APE-1的肝癌細胞Hep 3B中低表達(

P

<0.05)，見圖5A。組織中免疫組化結果表明TNFAIP3、MAP2K6在肝癌組織中高表達(

P

<0.05，

t

=3.407,

t

=3.388)，見圖5B。

圖5 TNF信號通路基因TNFAIP3、MAP2K6在不同情況下的表達差異

2.5 APE-1和TNFAIP3、APE-1和MAP2K6表達

相關性分析

基于TCGA數據庫可視化軟件starBase中374例肝癌患者數據，分析表達相關性。結果表明，APE-1和TNFAIP3，APE-1和MAP2K6表達均呈正相關(

P

<0.001)，見圖6。

圖6 APE-1和TNFAIP3、APE-1和MAP2K6肝癌中表達相關性分析

3 討論

HCC發病率、病死率居高不下，缺乏特異性腫瘤分子標記物及治療靶點是重要原因之一；發現HCC相關致病基因，并在研究其作用機制基礎上尋找治療新靶點是腫瘤生物學的重要內容。近年來，氧化還原因子APE-1在腫瘤發展中的作用越來越受到人們的重視。多項研究表明APE-1在前列腺癌、透明細胞腎細胞癌、橫紋肌肉瘤、乳腺癌、非小細胞肺癌、卵巢漿液性癌、胃癌、食管鱗狀細胞癌、膀胱癌中存在差異表達。Kim et al檢測血清APE-1的表達尋找透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinomas, ccRCC)，HCC以及近端和遠端膽管癌(cholangio carcinoma, CC)的生物標志物，發現胞質APE-1表達增加導致HCC和CC病例的無病生存期縮短，暗示APE-1表達水平可能是ccRCC、HCC和CC的潛在診斷生物標志物，也可用于預測HCC或CC患者的復發。McIlwain et al在前列腺癌(prostate cancer, PC)中研究表明，PC標本中的survivin和APE-1高表達，并且小分子抑制劑APX3330和第二代抑制劑APX2009對APE-1氧化還原特異性抑制作用可以降低PC細胞增殖并誘導細胞周期停滯，抑制APE-1可降低NF-κB轉錄活性。

在肝癌中，該課題組前期研究結果顯示APE-1在肝癌組織和細胞中表達升高，其表達與TNM分期、組織病理分級存在差異。沉默APE-1表達可降低肝癌細胞Hep 3B細胞增殖活性，提高細胞凋亡率。APE-1在肝癌細胞中表現出了較強的抗腫瘤潛能。

通過高通量測序技術檢測沉默APE-1表達對肝癌細胞Hep 3B轉錄組的影響。結果表明沉默APE-1表達導致肝癌細胞Hep 3B中123個基因表達發生變化，差異最明顯的前10位基因分別為APE-1、CEMIP、MAP2K6、TAF11L11、CNGB1、COL5A3、OTULINL、DNAJC12、FOLR1、ACKR3。差異基因功能富集結果表明其主要參與TNF信號傳導、腫瘤轉錄失調通路。

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)是一種可以直接殺傷腫瘤細胞，對正常細胞沒有明顯的細胞毒性的細胞因子，是細胞凋亡以及炎癥和免疫的主要介質，它與多種人類疾病的發病機制有關，包括癌癥、敗血癥、糖尿病、骨質疏松癥、多發性硬化癥、類風濕關節炎和炎癥性腸病。

TNF與TNF-R1的相互作用激活多種信號轉導途徑，包括NF-kB和MAPK途徑。針對TNF信號轉導通路中的關鍵性差異表達蛋白TNFAIP3、MAP2K6，通過免疫組化方法驗證在臨床肝癌組織樣本中均高表達。進而基于癌癥和腫瘤基因圖譜計劃(the cancer genome atlas，TCGA)腫瘤標本數據庫中374例肝癌患者數據，分析APE-1和TNFAIP3，APE-1和MAP2K6表達相關性，結果表明APE-1和TNFAIP3，APE-1和MAP2K6表達均呈正相關(

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<0.001)，暗示APE-1可能通過影響TNF信號轉導發揮作用。

此外，轉錄組分析結果還表明差異基因參與N-聚糖生物合成、碳水化合物的消化吸收、近端小管碳酸氫鹽回收、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝等。研究表明糖代謝與免疫治療逃逸相關，而APE-1在肝臟中也發揮著免疫逃逸的功能。筆者通過建立大鼠原位肝移植模型，發現APE-1蛋白的過表達可以增強移植物免疫逃逸。這些結果提示APE-1沉默可能抑制腫瘤細胞的免疫逃逸，促進腫瘤細胞免疫應答反應。提示免疫治療可能是治療肝癌的有效手段。然而腫瘤免疫應答過程比較復雜，肝癌中APE-1差異表達對免疫治療的影響還需要更詳細的機制研究。

綜上所述，該研究通過沉默APE-1對肝癌細胞Hep 3B轉錄組表達譜的分析，提示APE-1是肝癌發生發展中關鍵的抗腫瘤基因，其可能通過影響TNF信號通路發揮作用。