亞硒酸鈉對肺癌細胞生物學行為的影響及其相關機制研究

許 曉，李 明，范理宏

硒是地殼中普遍存在的一種非均勻分布的金屬，在人體生長發育過程中發揮著十分重要的作用。同時有大量研究顯示硒具有抗癌、抗氧化、增強人體免疫力、調節蛋白質合成的功能，在人體的發病機制與穩態中扮演著重要角色，它與威脅人類健康和生命的多種疾病，如癌癥、心血管疾病、多囊卵巢綜合征等密切相關。與此同時還有研究表明硒可以減輕伊立替康、環磷酰胺等放化療藥物的毒性作用，改善患者預后。亞硒酸鈉是最常見的無機硒的存在形式，有研究表明它可以影響肝癌、乳腺癌、膀胱癌等多種癌細胞的增殖、凋亡和遷移。肺癌是對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤，但關于亞硒酸鈉抗肺癌的研究較少且具體機制不明確。該研究通過體外實驗，研究亞硒酸鈉對肺癌A549細胞系增殖、遷移的抑制作用以及初步驗證亞硒酸鈉促進凋亡的具體作用機制。

1 材料與方法

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1 試劑與儀器

亞硒酸鈉(sodium selenite)購自美國Sigma-Aldrich公司；NF-κB抑制劑(BAY11-7082)購自美國MCE公司；RPMI 1640 培養基購自美國Gibco 公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；NF-κB激活-核轉運檢測試劑盒和IkBα、p-IkBα、Bax、Bcl-2抗體均購自上海碧云天生物公司；NF-κB、p-NF-κB、β-actin抗體均購自美國Cell Signaling 公司。由上海生物工程技術服務有限公司設計合成Bcl-2、Bax引物；mRNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、SYBR Green qPCR Master Mix均購自美國EZBioscience公司；蛋白裂解液(RIPALysis Buffer)、BCA 蛋白定量試劑盒、CCK-8試劑盒均購自上海翊圣生物有限公司。

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2 細胞培養

肺癌A549細胞購自上海中國科學院細胞培養庫，在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養基中培養并置于37 ℃、5% CO的恒溫培養箱中培養，2 d更換1 次培養基。

1.3 CCK-8細胞增殖實驗

將肺癌A549細胞按照4 000～5 000個/孔的濃度鋪于96孔板中，待細胞完全貼壁且細胞匯合度達70%～80%后，棄去96孔板內培養基，用含有10%胎牛血清、雙抗的RPMI 1640完全培養基稀釋亞硒酸鈉，初始濃度為5 782.35 μmol/L，依次進18次的倍比稀釋，將倍比稀釋的亞硒酸鈉依次按照濃度梯度，由低到高的順序分別加入96空板中。培養24 h后，棄去96孔板內培養基，每孔內加入100 μl不含RPMI 1640培養基和10 μl CCK-8，孵育1～2 h后，用酶標儀檢測各孔的A值，將所得吸光度按照如下計算公式進行計算：增殖抑制率=(對照組A-實驗組A)/(對照組A-空白組A)×100%，實驗重復3次。

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4 流式細胞術

將肺癌A549細胞按照4～5×10個/孔的濃度接種于6孔板中，用亞硒酸鈉(14 μmol/L)培養24 h后，待細胞完全貼壁且細胞匯合度達70%～80%后，用PBS清洗細胞2次，10%胰蛋白酶消化2～3 min后，收集細胞，800 r/min離心3 min吸除上清液，加入buffer，輕輕重懸細胞，加入用50 μl buffer稀釋的2.5 μl AnnexinV-FITC染料，37 ℃避光染色孵育15～20 min，再加入用250 μl buffer稀釋的5 μl碘化丙啶(PI)染料，37 ℃避光染色孵育10 min，最后通過流式細胞儀PI和FITC通道對照組和亞硒酸鈉組細胞凋亡率進行檢測，實驗重復3次。

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5 劃痕實驗

取對數生長期的肺癌A549細胞按照4～5×10個/孔的濃度鋪于6孔板中，在恒溫培養箱中培養24 h，待細胞融合達100%后，用200 μl槍頭分別在6孔板內進行劃痕，并拍照記錄然后用不含胎牛血清RPMI 1640培養基和不含胎牛血清RPMI 1640培養基溶解的亞硒酸鈉(14 μmol/L)培養肺癌A549細胞24 h后，拍照記錄劃痕愈合情況，比較2次結果，實驗重復3次。

1.6 總RNA的提取和qPCR 用亞硒酸鈉和BAY11-7082干預肺癌A549細胞

24 h，收集細胞，按照試劑盒說明書，提取RNA，逆轉錄cDNA，進行qPCR檢測，以GAPDH為內參，引物序列分別為：Bax上游引物GGAGATGAACTGGACAGCAATA，下游引物GAAGTTGCCATCAGCAAAC；Bcl-2上游引物GTGGATGACTGAGTACCTGAAC，下游引物GAG ACAGCCAGGAGAAATCAA。按照說明書設置反應程序，目標基因的表達水平用2比較法進行評估，實驗重復3次。

1.7 Western blot實驗

細胞經過藥物處理以后，用PBS清洗3遍，6孔板中每孔加入80 μl含PMSF的裂解液，冰上裂解40～60 min后，用刮棒刮取蛋白收入EP管中，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。用BCA試劑盒對所提取的蛋白進行定量，定量結束以后加入Loading buffer 100 ℃ 加熱10 min(樣品放入-20 ℃儲存)。取20 μg進行上樣，以80 V恒定電壓SDS-PAGE電泳80～90 min，以250 mA恒定電流轉膜80 min，2% BSA封閉1 h，加入對應的一抗：NF-κB、p-NF-κB、β-actin、Bcl-2、Bax，4 ℃過夜，PBST清洗3次，每次約15 min，加入相應的二抗常溫孵育1 h，PBST清洗3次，每次約15 min。使用ECL印跡檢測試劑顯影拍照，實驗重復3次。

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8 免疫熒光

將肺癌A549細胞分為對照組、14 μmol/L亞硒酸鈉組、10 μmol/L BAY11-7082組以及14 μmol/L亞硒酸鈉+10 μmol/L BAY11-7082組細胞，經過藥物處理24 h后，吸除培養液，用PBS洗3次，按照試劑盒說明書進行固定，染色封閉液，4 ℃孵育過夜NF-κB抗體，室溫孵育抗兔Cy3 1 h，細胞核染色液(DAPI)，室溫下染色5 min，封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 亞硒酸鈉抑制肺癌A549細胞的增殖

將濃度5 782.35 μmol/L的亞硒酸鈉作為起始濃度，進行倍比稀釋，一共稀釋19個濃度梯度，干預24 h以后，CCK-8結果顯示隨著藥物濃度的不斷增加，其抑制效率也會隨之不斷增加，同時通過計算得出肺癌A549細胞24 h亞硒酸鈉的IC值約為14 μmol/L。見表1。

表1 亞硒酸鈉的濃度對肺癌A549細胞增殖能力的影響

2.2 亞硒酸鈉抑制肺癌A549細胞遷移能力

將經劃痕、拍照處理后的肺癌A549細胞分為對照組和14 μmol/L亞硒酸鈉組，處理24 h后，結果顯示，與對照組相比用14 μmol/L的亞硒酸鈉處理后的肺癌A549細胞的遷移的能力明顯受到抑制。見圖1。

圖1 亞硒酸鈉對與肺癌A549細胞遷移能力的影響 ×200

2.3 亞硒酸鈉促進肺癌A549細胞的凋亡

將A549細胞分為2組，一組不做任何處理(對照組)，另外一組用14 μmol/L亞硒酸鈉干預24 h以后，流式細胞儀凋亡分析結果顯示，與對照組相比用14 μmol/L的亞硒酸鈉處理后的肺癌A549細胞的凋亡明顯增加，對照組細胞凋亡率為(7.08±5.32)%，14 μmol/L亞硒酸鈉組細胞凋亡率為(26.16±1.41)%(圖2)(

P

<0.05，

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=6.004)；與此同時，用6、14、28 μmol/L不同濃度亞硒酸鈉處理肺癌A549細胞24 h后，Western blot結果顯示，6、14、28 μmol/L 亞硒酸鈉組Bcl-2蛋白的表達水平與對照組相比均下降且隨亞硒酸鈉濃度增加而逐漸下調，而Bax蛋白的表達水平與對照組相比均上調且隨亞硒酸鈉濃度增加而逐漸上調；qPCR結果也顯示，肺癌A549細胞的Bcl-2 mRNA表達水平隨亞硒酸鈉濃度增加而逐漸下調(

P

<0.05，

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=6.675、17.530、45.870)，而Bax mRNA表達水平隨亞硒酸鈉濃度增加而逐漸上調(圖3)(

P

<0.05，

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=16.56、16.94、157.70)。

圖2 亞硒酸鈉干預后細胞的凋亡情況

圖3 Western blot和qPCR 檢測凋亡相關因子Bcl-2和Bax的蛋白及mRNA的表達水平

2.4 亞硒酸鈉抑制肺癌A549細胞NF-κB的信號通路活化

亞硒酸鈉對NF-κB信號通路的影響如圖4所示，經過亞硒酸鈉處理的A549細胞，其p-NF-κB、p-IkBα蛋白的表達明顯下降，蛋白的表達量與亞硒酸鈉濃度呈負相關。免疫熒光結果顯示，對照組核內熒光明顯強于14 μmol/L亞硒酸鈉組、10 μmol/L BAY11-7082(NF-κB抑制劑)組以及14 μmol/L亞硒酸鈉+10 mol/L BAY11-7082組，與10 μmol/L BAY11-7082組相比，14 μmol/L亞硒酸鈉組的核內熒光強度與之相近，且二者聯合使用熒光強度最弱(圖5)，這說明亞硒酸鈉可能抑制肺癌A549細胞NF-κB的信號通路活化。與此同時，qPCR結果顯示與對照組相比，14 μmol/L亞硒酸鈉組、10 μmol/L BAY11-7082組以及14 μmol/L亞硒酸鈉+10 μmol/L BAY11-7082組的Bax mRNA的表達量均增加(

P

<0.05，

t

=83.77、10.99、48.64)，而Bcl-2 mRNA的表達量均下降(

P

<0.05，

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=625.5、185.7、275.5)(圖6)，上述結果提示亞硒酸鈉可通過抑制NF-κB信號通路活化促進肺癌A549細胞的凋亡。

圖4 Western blot 檢測p65(NF-κB)、p-p65(pNF-κB)、IkBα、p-IkBα的蛋白表達水平

圖5 免疫熒光觀察p-p65的表達 ×200

圖6 qPCR比較BAY11-7082和亞硒酸鈉對肺癌A549細胞凋亡的作用

3 討論

該研究通過細胞增殖實驗、Western blot、qPCR和細胞免疫熒光等實驗表明亞硒酸鈉可以抑制肺癌A549細胞的增殖和遷移，同時還表明亞硒酸鈉促進肺癌A549細胞的凋亡的具體機制與NF-κB信號通路的活化相關。

亞硒酸鈉作為無機硒的一種，它具有廣泛的抗腫瘤的作用。有研究表明，亞硒酸鹽可以通過降低線粒體膜電位(MMP)、增加超氧化物的產生、減少ATP合成、破壞溶酶體膜和激活自噬的方式，實現促進腫瘤細胞凋亡的目的。還有研究表明，在鼻咽癌細胞的研究中，亞硒酸鈉可以增加Bax的表達，減少Bcl-2的表達，降低了MMP的表達，誘導Bax從細胞質轉位到線粒體，增加Caspase-3活性，進而達到抗增殖和誘導凋亡作用，且亞硒酸鈉抑制腫瘤細胞增殖和促進其凋亡的作用具有劑量和時間依賴性。與此同時，CCK-8的結果表明，亞硒酸鈉可以抑制肺癌A549細胞的增殖，并且伴隨亞硒酸鈉濃度的不斷上升其抑制作用也逐漸加強；通過劃痕實驗發現亞硒酸鈉抑制肺癌細胞的遷移；通過流式細胞術、Western blot和qPCR實驗，結果顯示亞硒酸鈉具有促進肺癌A549細胞凋亡的作用。綜上所述，亞硒酸鈉可以抑制肺癌A549細胞增殖和遷移以及誘導肺癌A549細胞的凋亡。

NF-κB是一類由p50、p52、NF-κB、c-Rel和RelB兩兩組合形成二聚體核轉錄因子，其中p50和NF-κB所構成的異源二聚體是NF-κB經典信號通路的重要組成部分，它能特異性結合免疫球蛋白κ輕鏈基因的上游增強子序列并激活基因轉錄。NF-κB轉錄因子正常情況下會與IkBα 結合成三聚體并以無活性的形式存在于細胞質中，當細胞受到如炎癥因子、脂多糖等因子刺激后會使IkK復合物激活，此時IkBα 會發生磷酸化并迅速降解，使NF-κB核轉錄因子活化并發生轉位，進入細胞核中發揮調控基因表達的作用。NF-κB信號通路作為調節免疫發育、免疫反應、炎癥的關鍵通路，近年來的大量文獻顯示NF-κB信號通路參與干擾腫瘤發生發展的不同階段。在關于肺癌A549和乳腺腫瘤細胞與人腦微血管內皮細胞(HBMECs)相互作用研究中表明，特定的硒化合物能夠通過下調NF-κB來抑制腫瘤細胞與腦內皮細胞的黏附和跨內皮細胞的遷移，從而使腫瘤細胞的轉移能力受到抑制。在關于乳腺癌的研究中表明亞硒酸鈉可以通過瞬態增加細胞內活性氧(ROS)，抑制NF-κB信號通路的活化，Bax表達上升，Bcl-2 的表達下降，激活Caspase 9和Caspase 3，促進乳腺癌細胞的凋亡。與此同時，有文獻報道肺癌細胞的生成和增殖與NF-κB信號通路活化密切相關，在具有高NF-κB活性的小鼠肺腺癌細胞系中，硼替佐米與Bay-117082(NF-κB抑制劑)通過抑制NF-κB的磷酸化和入核，誘導癌細胞凋亡。因此，抑制NF-κB信號通路的活化被認為可能是治療肺癌A549的有利途徑。該研究表明，亞硒酸鈉可使肺癌A549細胞中p-NF-κB和p-IkBα 的表達下降，同時伴著亞硒酸鈉濃度的不斷增加，p-NF-κB和p-IkBα 表達逐漸降低；免疫熒光結果提示亞硒酸鈉可以抑制NF-κB的入核。從上述結果分析亞硒酸鈉可以抑制肺癌A549細胞NF-κB的磷酸化，進而影響NF-κB的入核，干擾相關基因表達。