皮質下缺血性血管病與對氧磷酶1基因多態性的相關性研究
2021-08-04 09:42:34高文平宋莉莉倪明珠王兆平王文靜
安徽醫科大學學報 2021年7期
高文平，宋莉莉，王 瑤，倪明珠，王兆平，王文靜
皮質下缺血性血管病(subcortical ischemic vascular disease, SIVD)是一種以彌漫性腦白質病變(white matter lesions, WML)和多發腔隙性梗死(lacunar infarction, LI)為特征的腦小血管病，是血管性癡呆(vascular dementia, VaD)的主要亞型之一，雖然其發病率較高，但均質性較好，成為近年來學者們研究的熱點。SIVD的確切發病機制尚不清楚，近年來的研究表明其與遺傳因素、動脈粥樣硬化、Aβ蛋白沉積、血腦屏障損害等有關。對氧磷酶1(paroxyphospase 1, PON1)是一種芳香酯酶，具有抗氧化及抗動脈粥樣硬化的作用，其活性及表達主要受PON1基因Q192R和L55M位點基因多態性的影響。有研究表明，PON1活性降低可能與缺血性腦卒中、冠心病等動脈粥樣硬化相關的疾病發生有關。因此，PON1基因多態性可能也與SIVD的發病相關，目前兩者間的關系尚無定論。該研究擬通過臨床資料的收集對比、影像上的差異以及基因檢測的方法探索PON1基因多態性與SIVD疾病的相關性，為尋找防治SIVD的新靶點提供一定的理論依據。
1 材料與方法
1.1 病例資料
隨機選取2019年11月—2020年6月在安徽醫科大學附屬省立醫院神經內科就診的SIVD患者65例。SIVD組納入標準參照Erkinjuntti提出的診斷標準并加以修訂：① 年齡50～85(66.28±8.80)歲；② 頭顱磁共振(MRI)檢查T2、Flair成像提示皮質下多發LI(LI≥5個)和(或)腦室旁及深部廣泛WML(Fazekas分級≤2級)；③ 近6個月內無急性LI發生。SIVD組排除標準：① 有皮質梗死、腦腫瘤、腦外傷、顱腦手術、腦出血史；② 非血管性因素引起的腦白質病變：如代謝、多發性硬化、免疫、中毒等；③ 有風濕性疾病、感染性疾病、血液系統疾病、嚴重肝腎功能不全等；④ 近1月有手術史。對照組納入標準：選取同時期年齡50～85(61.26±7.99)歲、一般臨床資料相仿、頭顱MRI正常的體檢者35例作為對照組。所有研究對象及家屬均知情同意并簽署知情同意書。1.2 方法
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臨床資料的收集 一般資料包括年齡、性別、高血壓、糖尿病、冠心病、心房顫動、肝腎疾病、吸煙飲酒史等。實驗室檢測包括血糖、血脂、同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)、肝腎功能等指標。1
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影像學檢查 采用3.0 T MRI機(德國西門子公司)掃描，根據頭顱MRI T1、T2和Flair像，評估所有受試者的腦損傷程度。LI的數量：計皮質下直徑3～15 mm、邊界清晰的缺血灶數量。參照Fazekas分級方法將WML進行分級：0級(無白質病變)，1級(輕度，病變為斑點狀)，2級(中度，病變開始融合)，3級(重度，病變融合為彌漫性病變)。SIVD組WML和LI常合并存在，無法絕對區分，可依據Fazekas分級及LI數量將所有SIVD組受試者分為WML組和LI組，并分別按照腦損傷程度不同等級進行以下分組：① WML組(以WML為主且LI數量≤5個)：輕度WML組(Fazekas分級為1級)、中度WML組(Fazekas分級為2級)、重度WML組(Fazekas分級為3級)；② LI組(以LI為主，可伴有腦白質損害)：輕度LI組(LI數量≤5個)、中度LI組(5個1
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標本的采集和PON1基因型的檢測 使用EDTA抗凝管采集受試者清晨空腹肘靜脈血2 ml，于-80 ℃冰箱凍存。采用sanger測序法檢測所有受試者的PON1基因Q192R及L55M兩個位點的基因型。① 按照Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物公司)說明書提取白細胞DNA；② 引物設計：使用Primer Premier 5軟件設計引物，Q192R基因上游引物序列為5′-ATTTCAGAGAGTTCACATACTTGCC-3′，下游引物序列為5′-GAATAGACAGTGAGGAATGCCAG-3′，擴增片段308 bp；L55M基因上游引物序列為5′-TTATTTGAAAGTGGGCATGGG-3′，下游引物序列為5′-TCAAGTGAGGTGTGATAAAGAAATG-3′，擴增片段244 bp；③ PCR反應：PCR反應體系總體積為25 μl，模板DNA 2 μl，上下游引物各1 μl，dNTP(Mix)1 μl，10×Taq buffer(含MgCl)2.5 μl，Taq酶0.2 μl，加雙蒸水至25 μl；PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環38次，72 ℃修復延伸10 min；④ DNA測序及SNP分型：取5 μl PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，采用sanger測序法進行測序及SNP分型，由美國ABI 3037 XL全自動測序儀得出DNA測序峰圖。1
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吸煙和飲酒的定義 ① 吸煙定義：平均吸煙≥1支/d，持續時間>12個月，吸煙狀況分為不吸煙、目前吸煙和已戒煙，已戒煙是指曾經吸煙但已停止吸煙至少12個月；② 飲酒定義：過去1個月飲酒次數≥1次/周，飲酒狀況分為不飲酒、目前飲酒和已戒酒，已戒酒是指曾經飲酒但已停止飲酒至少6個月。
2 結果
2.1 SIVD組和對照組一般資料和腦損傷程度的比較
SIVD組和對照組性別、高血壓、糖尿病、飲酒狀況、血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)、同型半胱氨酸(Hcy)水平差異均無統計學意義。與對照組比較SIVD組的平均年齡增高(P
<0.05)，SIVD組的高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平降低(P
<0.05)，2組吸煙狀況有統計學差異(P
<0.05)。SIVD組的Fazekas分級及LI數量高于對照組(P
<0.001)。見表1。
表1 SIVD組與對照組一般臨床資料和腦損傷程度比較
2.2 SIVD組和對照組PON1基因Q192R、L55M位點測序結果、基因型分布和等位基因頻率比較
SIVD組和對照組PON1基因Q192R、L55M位點的測序圖分別如圖1、2所示。SIVD組和對照組PON1基因Q192R、L55M基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。SIVD組與對照組PON1基因Q192R和L55M基因型分布差異均有統計學意義(P
<0.05)，SIVD組R等位基因頻率和M等位基因頻率高于對照組(P
<0.05)。見表2。
表2 SIVD組與對照組PON1基因Q192R、L55M位點基因型分布和等位基因頻率比較[%，n(%)]
圖1 PON1基因Q192R位點測序圖
2.3 WML組和LI組PON1基因Q192R、L55M基因型分布和等位基因頻率比較
WML組和LI組PON1基因Q192R和L55M基因型分布和等位基因頻率差異均無統計學意義。見表3。
表3 WML組與LI組PON1基因Q192R、L55M位點基因型分布和等位基因頻率比較[%，n(%)]
2.4 WML組和LI組內不同等級腦損傷程度的
PON1基因Q192R、L55M基因型分布和等位基因頻率比較
① WML組分為輕度WML組、中度WML組和重度WML組，3組間PON1基因Q192R、L55M位點基因型分布差異均無統計學意義，Q192R、L55M位點等位基因頻率差異均有統計學意義(P
<0.05)。重度WML組R等位基因頻率分別高于中度WML組和輕度WML組(P
<0.016 7)，中度WML組和重度WML組的M等位基因頻率均高于輕度WML組(P
<0.016 7)。② LI組分為輕度LI組、中度LI組和重度LI組，3組間PON1基因Q192R、L55M位點基因型分布差異均無統計學意義，Q192R、L55M位點等位基因頻率差異均有統計學意義(P
<0.05)。重度LI組R等位基因頻率分別高于中度LI組和輕度LI組(P
<0.016 7)，中度LI組和重度LI組的M等位基因頻率均高于輕度LI組(P
<0.016 7)。其余組間兩兩比較差異均無統計學意義。見表4、5。
圖2 PON1基因L55M位點測序圖
表4 WML組內PON1基因Q192R、L55M位點基因型分布和等位基因頻率比較[%，n(%)]
表5 LI組內PON1基因Q192R、L55M位點基因型分布和等位基因頻率比較[%，n(%)]
2.5 SIVD危險因素的多因素Logistic回歸分析
將有無SIVD作為因變量，將年齡、吸煙、HDL水平、攜帶R等位基因、攜帶M等位基因作為自變量，進行Logistic回歸分析。在回歸方程中，將有SIVD賦值為1，無SIVD賦值為0；吸煙：不吸煙賦值為0，已戒煙賦值為1，目前吸煙賦值為2；攜帶R等位基因：QQ基因型賦值為0，QR基因型賦值為1，RR基因型賦值為2；攜帶M等位基因：LL基因型賦值為0，LM基因型賦值為1。年齡及HDL-C水平均以連續型變量直接納入模型。結果顯示：在控制各項因素后，年齡、吸煙、攜帶R等位基因、攜帶M等位基因均為SIVD患病的獨立危險因素。見表6。
表6 SIVD影響因素多因素Logistic回歸分析
2.6 PON1基因Q192R和L55M位點多態性的交互作用分析
通過條件Logistic回歸，在調整年齡、吸煙及HDL-C水平等因素后，Q192R位點和L55M位點多態性對SIVD患病無統計學交互作用(P
=0.908,OR
=1.438, 95%CI
=0.003～692.434)。3 討論
以WML和LI為特征的SIVD是老年人中較常見的腦小血管病，其起病較隱匿，早期認知功能可能正常，隨著病情進展逐漸出現認知能力下降。其臨床表現除認知障礙外，還包括步態異常、假性球麻痹、尿便障礙和錐體外系癥狀。因此，早期發現對于及時治療和改善預后至關重要。
對氧磷酶(paraoxonase, PON)基因家族都與抗動脈粥樣硬化相關，其中PON1的抗動脈粥樣硬化活性最強，被學者們廣泛研究。PON1是一種Ca依賴的酯酶，在血液中與高密度脂蛋白(HDL)緊密結合，可防止低密度脂蛋白(LDL)氧化，促進HDL的抗動脈粥樣硬化，在調節膽固醇反向轉運(reverse cholesterol transport, RCT)、抗氧化、抗凋亡、抗炎、血管舒張和抗血栓形成以及幾種內皮細胞功能中也發揮作用，與冠心病、缺血性腦卒中等疾病密切關聯。PON1基因位于人類第7號染色體長臂(7q21.3～q22.1)上。有研究表明，人血清中的PON1活性有40倍的差異，這可能是由PON1基因編碼區的多態性共同決定的，其中Q192R和L55M位點的多態性表現發揮主要作用。
目前，PON1的基因多態性與SIVD的關系尚無定論。該研究結果顯示，SIVD組PON1基因192位的R等位基因頻率和55位的M等位基因頻率均高于對照組，根據腦損傷程度不同等級進一步分組發現，WML組內和LI組內病變程度較高的組別其R和M等位基因頻率更高，提示其R和M等位基因可能在SIVD的發病和腦損傷的過程中均有一定的促進作用。條件Logistic回歸和多因素Logistic回歸分析結果提示，攜帶其R和M等位基因均為SIVD患病的獨立危險因素，且攜帶M等位基因對SIVD發病的影響可能更大。
因此，SIVD的發病可能與PON1基因Q192R和L55M位點的多態性表現相關。具體而言，其R和M等位基因影響SIVD的發生發展的機制可能如下：① PON1基因Q192R和L55M基因多態性可影響PON1的活性，攜帶R等位基因雖比攜帶Q等位基因的PON1活性更高，但攜帶R等位基因會抑制PON1對LDL免受氧化的保護，而攜帶M等位基因相比攜帶L等位基因的PON1活性較低，因此，攜帶R等位基因與攜帶M等位基因均可使PON1的抗動脈粥樣硬化功能受限。② PON1水解脂質過氧化物，保護LDL免受氧化，降低循環和血管壁中氧化的LDL，減少泡沫細胞的形成和巨噬細胞的氧化應激以及刺激HDL介導的RCT，促進內皮功能正常化，從而抗動脈粥樣硬化。③ PON1與HDL之間的聯系不僅是簡單的配體-載體關系，PON1也可以保護HDL免受氧化。血脂異常、氧化應激和炎癥均可引起HDL的結構劇烈變化，從而減弱HDL抗動脈粥樣硬化潛力。HDL結構的改變可影響PON1的活性，氧化的HDL增強PON1活性的能力也明顯降低。④ PON1也是一種乳酸酶，能降解同型半胱氨酸硫代內酯(HycTL)。HycTL是一種Hcy代謝物，可通過N型半胱氨酸化機制修飾蛋白的賴氨酸殘基，進而影響蛋白的結構和功能，導致氧化應激、內皮功能障礙、血栓形成、自身免疫反應、細胞死亡和動脈粥樣硬化。PON1通過代謝HycTL，限制蛋白的N同型半胱氨酸化，從而延緩動脈粥樣硬化的發展。
該研究對SIVD的影響因素進行了多因素Logistic回歸分析，結果顯示，吸煙與年齡增長也會增加SIVD的發病風險，這可能也與PON1的活性和表達降低有關。PON1的活性和表達也受年齡、炎癥、飲食、藥物、糖尿病、吸煙和生活方式的影響。有研究表明，吸煙者血清中PON1的活性和濃度低于非吸煙者，不過這種影響在戒煙后可消除，故而戒煙對于預防SIVD具有重要意義。同時，PON1活性也隨著年齡的增長而降低，這也與老年群體中HDL對氧化的敏感性增加有關。另外，該研究中未檢測到PON1基因55位MM基因型，可能與MM是一種較為罕見的基因型有關，這與國內外的研究結果一致。
綜上所述，盡管該研究的樣本量有限，未能對年齡、吸煙等因素進一步分層分析，但該研究的結果表明，SIVD的發病可能與PON1基因多態性有關，攜帶第192位R等位基因與第55位M等位基因可能對SIVD的發病有一定的促進作用，這些發現為尋找SIVD防治新的靶點具有重要意義。
