腹瀉型腸易激綜合征小鼠模型的建立與評價

彭 穎，徐麗紅，2

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種以腹部不適或疼痛為主要特征，并伴有大便性狀及排便習慣改變的功能性胃腸道疾病。臨床以腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，D-IBS)最為常見。D-IBS的病因復雜，其發病機制尚不明確，但目前有研究認為D-IBS患者存在腸道生理和內臟敏感性改變，這一改變可能與患者腸免疫功能紊亂相關。急性束縛實驗誘導的束縛應激模型是經典且廣泛應用于D-IBS研究中的動物模型，但既往研究多選用SD大鼠作為模型動物，朱華 等研究表明SD大鼠的免疫活性隨著月齡的增加而逐漸降低，故可能在腸道免疫學研究中存在缺陷。C57BL/6J小鼠因其細胞免疫力較少隨月齡增加而降低，因此，其常用于腸道免疫學研究，但目前利用C57BL/6J小鼠進行D-IBS研究的報道較少。

為開展D-IBS腸道免疫-炎癥機制相關研究，該實驗預利用急性束縛應激(wrap restrain stress，WRS)構建腹瀉型腸易激C57BL/6J小鼠動物模型，旨在評價WRS實驗誘導的C57BL/6J小鼠D-IBS模型的可行性并監測D-IBS小鼠模型中IBS癥狀相關指標和腸黏膜組織病理學的改變。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

64只雌性健康C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體質量16～18 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物合格證號：SCXK(京)，2016-0006。實驗動物飼養于石河子大學醫學院動物房。溫度為18～25 ℃，濕度為40%，光照與黑暗時間各12 h。該實驗通過石河子大學醫學院第一附屬醫院動物實驗倫理審查，批準號：A2020-165-01，將64只C57BL/6J小鼠常規飼養1周后按隨機數字表法分成對照組與實驗組，每組32只，共設定8個時間點，隨機分組每個時間點4只小鼠。

1.2 主要儀器及試劑

BX51光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、直徑3 mm鋼球(江蘇嘉耐特五金公司)、鄰甲苯胺-冰醋酸溶液(天津市富宇精細化工有限公司)、10%中性福爾馬林溶液(北京索萊寶生物科技有限公司)、蘇木精染劑(上海藍季科技發展有限公司)、伊紅染劑(天津市天新精細化工開發中心)。

1.3 D-IBS模型的制備

實驗組參考文獻采用WRS法建立D-IBS模型，用乙醚輕度麻醉小鼠，用紙膠帶包裹束縛小鼠前肩、前上肢及胸背部以限制其梳理面部、上頭和頸部,但不控制其活動。2～5 min內小鼠從乙醚麻醉中恢復，并可在籠子中自由走動，自由進食和飲水。每日束縛1次，每次束縛時間2 h，共持續14 d。

1.4 測量指標和方法

1

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4

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1

一般情況 觀察小鼠皮毛色澤、精神狀態、活動度及大便性狀。

1

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4

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2

糞便含水量 將裁剪得當的小塊濾紙放入提前預制小孔的EP管中，用千分位電子天平稱量總質量，每天固定時間用濾紙刮取小鼠的新鮮糞便后裝入EP管中，然后再次稱量總質量，2次數值相減得到新鮮糞便質量。再將EP管置于60 ℃烘干箱中烘干24 h，稱量烘干后的質量。每日測量2次，取均值作為當天糞便含水量。小鼠糞便含水量(質量%)=(新鮮糞便質量-烘干后糞便質量)/新鮮糞便質量×100%。

1

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4

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3

體質量 使用千分位電子天平稱量小鼠質量(g)，精確到小數點后2位，每只連續稱量3次，取均值作為當天質量。

1

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4

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4

腸道傳輸功能 參照參考文獻的方法，在實驗前將小鼠禁食24 h，吸入七氟烷麻醉，取直徑3 mm的小鋼球放入小鼠距肛門1～2 cm直腸內，自小鼠蘇醒后計時，記錄小鋼球排出時間。2組小鼠分別于實驗開始前1 d，實驗開始后的第2周和第4周進行腸道傳輸功能的測定。

1

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4

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5

組織大體改變 在第2、3、4、5、6、7周末時，2組小鼠各取4只用濃度1%戊巴比妥50～60 mg/kg 腹腔注射麻醉，剖腹觀察結腸外觀，并測量小鼠結腸長度；再沿系膜側剖開結腸，觀察腸黏膜有無水腫、潰瘍等現象。

1

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4

.

6

病理組織學觀察 取整段剪開的結腸后沖洗干凈，用10%中性福爾馬林固定24 h，切片，HE染色，行組織病理學觀察。

2 結果

2.1 一般情況

2組小鼠實驗開始前精神活躍，毛色黑亮，飲食、飲水量正常，排便呈橢圓形。實驗開始后，D-IBS組在接受束縛刺激后，易激惹，精神低下，毛色黯淡無光澤，飲食及飲水量與對照組比較均減少，糞便稀淌，整個實驗過程中，未見小鼠出現肉眼血便。對照組小鼠精神和毛色較實驗開始前無明顯變化，飲食及飲水量隨日齡增加而增長，排便正常。

2.2 糞便含水量

計算2組小鼠每周糞便含水量的均值，在實驗開始后第2周模型組糞便含水量達高峰，較同期對照組糞便含水量升高，差異有統計學意義(

t

=-12.769,

P

<0.001)，實驗開始后第7周模型組糞便含水量較同期對照組糞便含水量升高，差異有統計學意義(

t

=-6.463,

P

<0.001)；實驗開始后模型組小鼠糞便含水量均較實驗開始前升高(

F

=44.240,

P

<0.001)。見圖1A。

2.3 體質量

計算2組小鼠每周體質量的均值，實驗開始后第3周模型組小鼠體質量達最低，較同期對照組小鼠體質量降低，差異有統計學意義(

t

=7.889,

P

<0.001)；而后模型組小鼠體質量緩慢上升，實驗開始后第7周模型組小鼠體質量較同期對照組小鼠體質量降低，差異有統計學意義(

t

=4.112,

P

=0.006)；實驗開始后1、2、3、4、5、6周模型組小鼠體質量均較實驗開始前減輕(

F

=9.081,

P

<0.001)；見圖1B。

2.4 腸道傳輸功能測定

結果顯示模型組小鼠在進行束縛刺激前，小鋼珠排出的時間與對照組相比差異無統計學意義(

t

=1.314 ,

P

=0.213)；在實驗開始第2周(接受刺激后)排出小鋼球的時間較對照組加快(

t

=-11.193 ,

P

<0.001)；在接受束縛刺激4周后(實驗開始第4周)排出小鋼珠的時間與對照組相比差異無統計學意義(

t

=-0.259,

P

=0.800)，見圖1C。

圖1 D-IBS小鼠與正常小鼠糞便含水量、體質量、腸道傳輸功能隨時間變化趨勢的對比

2.5 組織學大體改變結果

模型組小鼠和對照組小鼠剖腹均可見結腸腸壁光滑，未見充血水腫，腸道組織與周圍器官無粘連。取全段結腸，模型組小鼠的結腸長度[(8.23±0.6)cm]較對照組[(8.64±0.5)cm]縮短，差異有統計學意義(

t

=2.707,

P

=0.009)。

2.6 組織病理學改變結果

光鏡下觀察模型組小鼠結腸表面上皮完整，腺體排列規則，未見潰瘍；黏膜呈輕度慢性炎癥反應，炎癥主要累及黏膜固有層，炎性細胞以淋巴細胞為主；對照組小鼠結腸表面上皮完整，腺體排列規則，無潰瘍；黏膜下無充血、水腫，無炎性細胞浸潤。見圖2。

圖2 模型組與對照組遠端結腸組織病理學改變 HE染色

3 討論

根據羅馬Ⅳ診斷標準將IBS分為D-IBS、便秘型(constipation-predominant IBS,C-IBS)、混合型(mixed-type IBS，M-IBS)以及不定型(unsubtyped IBS,U-IBS)4種類型，其中D-IBS是IBS的主要亞型，占IBS病例的23.3%～65.0%，且患病率呈逐年上升趨勢。但到目前為止，D-IBS的發病機制仍未闡明。現有研究認為，其發生發展可能與心理壓力、中樞過度緊張、神經內分泌異常、胃腸道蠕動紊亂、黏膜免疫激活、腸屏障功能障礙、內臟超敏性、腸道菌群改變和遺傳易感性等因素相關，近年來，越來越多的研究表明D-IBS腸道黏膜存在持續的低度炎癥，推測其發生發展可能啟動了免疫-炎癥機制，但具體機制不詳，需進一步探討。

現有的D-IBS動物模型的制備方法主要包括應激、結直腸球囊擴張、化學藥物誘導、基因敲除和寄生蟲感染等，這些方法所制備的模型各有其特征和獨特作用，其中應激導致的D-IBS模型因其較其他幾種模型操作簡便、時間短、重復性好、經濟實用且最符合RomeIII標準提出的生物-社會-心理醫學模式而廣泛應用。應激模型包括急性應激模型、慢性應激模型、急-慢性應激模型和母嬰分離模型等，其中慢性應激模型和急-慢性應激模型造模方法成本高且需要投入大量的精力；母嬰分離模型雖然制作簡單，但有文獻指出造模結束后模型動物成年后并未出現腸道動力改變,也沒有排便習慣改變及大便性狀異常，故該模型具有一定局限性；WRS模型制作方法簡單、模型穩定性高、模型制備時間短，能使模型小鼠產生胃腸功能亢進、內臟敏感性增高以及精神活動失調的病理表現，能較好的模擬人類D-IBS癥狀，且不造成模型動物腸道潰瘍形成，因此，其在D-IBS的研究中被廣泛應用。故該實驗選用WRS實驗作為動物模型制備方法。

目前，在關于D-IBS的相關研究中，大多研究選擇的動物模型為SD大鼠，但有文獻指出SD大鼠的免疫活性隨著月齡的增加而逐漸降低，故可能不適用于腸道免疫學的研究，且有研究表明模型大鼠雖出現了糞便含水量增加，體質量減輕，腸道傳輸功能增加等類似人類D-IBS的癥狀，但其模型大鼠腸道黏膜出現了黏膜表面輕度糜爛，這與人類的D-IBS表現存在不同；而C57BL/6J小鼠因其免疫系統相對穩定，其免疫系統活性較少因月齡的增加而降低，故適宜用于腸道免疫學的相關研究。該研究預選擇以C57BL/6J小鼠作為模型動物。

人類D-IBS的主要癥狀以腹痛、腹部不適、腹瀉為主，D-IBS患者結腸黏膜上皮層及固有層淋巴細胞計數明顯高于健康人群。該實驗選用WRS實驗誘導的C57BL/6J小鼠D-IBS模型，實驗開始后模型組小鼠糞便含水量均較實驗開始前升高(

F

=44.240,

P

<0.001)，且均高于同期對照組小鼠糞便含水量(均

P

<0.05)；實驗開始后1、2、3、4、5、6周模型組小鼠體質量均較實驗開始前減輕(

F

=9.081,

P

<0.001)，且均低于同期對照組小鼠體質量(均

P

<0.05)；模型組小鼠在實驗開始第2周(接受束縛刺激后)排出小鋼球的時間較對照組加快(

t

=-11.193 ,

P

<0.001)；腸黏膜組織大體觀察，模型小鼠結腸腸壁光滑，無充血水腫，腸道組織與周圍器官無粘連，未見明顯器質性病變；模型組小鼠結腸長度雖較對照組縮短，但與對照組小鼠相差不大，推測可能和小鼠體質量偏低、體型偏小有關；顯微鏡下病理組織學觀察，表面上皮完整，腺體排列規則，無膿腫、潰瘍，炎癥主要累及黏膜固有層，炎性細胞以淋巴細胞為主。該實驗結果提示，模型小鼠糞便含水量增加，腸道傳輸功能亢進，體質量減輕，腸黏膜無潰瘍形成，且存在顯微鏡下慢性炎性改變，與人類D-IBS的臨床癥狀和病理組織學改變極為相似，故可認為該實驗模型制備成功。