槐果堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖凋亡的作用機(jī)制

符丹丹，段麗娜，柏玉舉，劉鳳嬌

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的一種惡性腫瘤，據(jù)報(bào)道全球每年約有160萬人死于肺癌，占所有癌癥死亡人數(shù)的20%，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。槐果堿(sophocarpine)即13,14-脫二氫苦參堿，是分離自苦參中的一種苦參類生物堿，槐果堿作為一類廣譜抗腫瘤藥物已被發(fā)現(xiàn)在胃癌、肝癌、多種婦科腫瘤、直腸癌等多種腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用。然而槐果堿在肺癌中發(fā)揮抗腫瘤作用的報(bào)道較少，且其作用機(jī)制尚未被完全揭示。因此，該研究選取肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞，應(yīng)用槐果堿作用細(xì)胞后分析細(xì)胞增殖、凋亡以及相關(guān)蛋白表達(dá)情況的改變，并探究其可能的作用機(jī)制，以期為研發(fā)新的抗肺癌藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

A549細(xì)胞購自南京科佰細(xì)胞庫；槐果堿購自南京普怡生物科技有限公司，批號(hào)190221，純度98%；RPIM-1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清(FBS)、雙抗、胰酶均購自美國Gibco公司；MTT試劑盒購自天津奧淇洛譜生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)耗材購自美國Corning公司；DMSO、Triton X-100、鼠源BrdU單抗、Annexin V-FITC試劑盒均購自美國Sigma公司；基質(zhì)膠購自美國BD公司；TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)購自上海翊圣生物科技有限公司；RIPA裂解液、上樣緩沖液均購自上海碧云天生物科技有限公司；鼠源增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、MYC、Bax、Bcl-2、L-PTGDS和PTGDR2單抗、鼠源GAPDH一抗及熒光標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAPI購自德國Thermo公司。

1.2 MTT實(shí)驗(yàn)

分組及處理：收集生長至對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞，制備密度為2×10/ml的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液隨機(jī)分為8組接種于96孔板中，1～7組分別給予100 μl濃度為1、2、4、8、16、32、64 mmol/L的槐果堿處理，8組給予100 μl PBS緩沖液處理，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，給予相應(yīng)濃度槐果堿處理后，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每孔加入10 μl MTT工作液于培養(yǎng)箱孵育3 h，每孔加入150 μl DMSO后置于搖床上低速振蕩15 min，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度(OD)值，按照抑制率=(1-給藥組OD值/對(duì)照組OD值)×100%計(jì)算抑制率。通過軟件分析結(jié)果并計(jì)算槐果堿對(duì)A549細(xì)胞的IC值。

1.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)

分組及處理根據(jù)1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取5 mmol/L槐果堿處理細(xì)胞進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)。制備細(xì)胞懸液方法同1.2，將細(xì)胞懸液隨機(jī)分為4組，分別為5 mmol/L槐果堿處理組(槐果堿組)及其對(duì)照組，5 ng/ml PGD2處理組(PGD2組)及其對(duì)照組，對(duì)照組給予等量PBS緩沖液處理。

以5 mmol/L槐果堿處理組及其對(duì)照組為例，分別取生長至對(duì)數(shù)期的槐果堿組和對(duì)照組A549細(xì)胞，胰酶消化吹打成單個(gè)細(xì)胞，用含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度約為50個(gè)/ml，以每孔2 ml的量接種于6孔板中，輕輕晃動(dòng)6孔板使細(xì)胞均勻分散開。置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)10～14 d，期間每隔3 d更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液。待培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄掉上清液，用PBS緩沖液輕輕洗滌3次，甲醇固定15 min，Gimesa染色液染色15～30 min，洗去染色液后室溫靜置干燥，觀察并記錄克隆形成數(shù)量。5 ng/ml PGD2處理組及其對(duì)照組克隆形成實(shí)驗(yàn)方法同上。

1.4 BrdU實(shí)驗(yàn)

分組及處理：根據(jù)1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取5 mmol/L槐果堿處理細(xì)胞進(jìn)行BrdU實(shí)驗(yàn)。制備細(xì)胞懸液方法同1.3，將細(xì)胞懸液隨機(jī)分為2組，分別為5 mmol/L槐果堿處理組及其對(duì)照組，對(duì)照組給予等量PBS緩沖液處理。

將2組細(xì)胞分別用胰酶消化離心重懸后，按1～2×10個(gè)/孔將細(xì)胞加入到24孔板中，孔中提前放置細(xì)胞爬片，待細(xì)胞密度生長至50%～60%時(shí)，加入1 mg/ml BrdU于培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行標(biāo)記，加入BrdU量以鋪滿24孔板孔面為宜，標(biāo)記48 h。PBS緩沖液晃動(dòng)清洗細(xì)胞爬片3次，每次5 min，4%多聚甲醛固定30 min。固定后用PBS洗滌3次，每次5 min，置于2 mol/L鹽酸中37 ℃變性5 min，再用0.1 mol/L硼酸鈉中和10 min，PBS洗滌3次，每次5 min。加入0.2% Triton X-100通透10 min，通透后棄掉Triton X-100，PBS洗滌3次，每次5 min。加入1 ml 3% BSA，室溫封閉1 h，PBS洗滌3次，每次5 min。加入按1∶200稀釋的鼠源BrdU單抗，4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次，每次10 min。加入按1∶100 稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫避光孵育1 h。PBS洗滌3次，每次10 min。加入1 mg/ml的DAPI染液染細(xì)胞核，按1∶1 000稀釋，室溫避光孵育10 min。PBS洗滌3次，每次10 min。中性樹膠封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

Western blot檢測(cè)PCNA、MYC、Bax、Bcl-2、L-PTGDS和PTGDR2蛋白：細(xì)胞分組方法同1.4，將細(xì)胞分為5 mmol/L槐果堿處理組及其對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后分別收取2組細(xì)胞樣品后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS緩沖液輕輕沖洗2次，加入現(xiàn)配的細(xì)胞裂解液，將細(xì)胞收集至1.5 ml離心管中，冰浴30 min，超聲儀破碎細(xì)胞樣品，4 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，95 ℃金屬浴煮沸。于SDS-PAGE膠上電泳，65 V恒壓電泳30 min，待溴酚藍(lán)標(biāo)記進(jìn)入分離膠后，更換為120 V電壓至電泳結(jié)束。再將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，封閉2 h，分別加入1∶1 000 稀釋的PCNA、MYC、Bax、Bcl-2蛋白的鼠源單抗，室溫孵育4～6 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入1∶2 000稀釋的對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。顯色液顯色后上機(jī)曝光分析各目的蛋白的相對(duì)含量，以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。

Western blot檢測(cè)L-PTGDS和PTGDR2蛋白：將A549細(xì)胞隨機(jī)分為2組，分別為5 ng/ml PGD2處理組和對(duì)照組，對(duì)照組給予等量PBS緩沖液處理，培養(yǎng)48 h后分別收取2組細(xì)胞樣品進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)方法同上，孵育一抗時(shí)替換為L-PTGDS和PTGDR2蛋白鼠源單抗。

1.6 TUNEL實(shí)驗(yàn)

分組及處理：將細(xì)胞隨機(jī)分為4組，分別為5 mmol/L槐果堿組及其對(duì)照組，5 ng/ml PGD2處理組及其對(duì)照組，對(duì)照組給予等量PBS緩沖液處理，根據(jù)分組分別進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

按照TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將處理后細(xì)胞分別接種于24孔板中，板中提前放入細(xì)胞爬片，待細(xì)胞長滿70%～80%時(shí)取出細(xì)胞爬片，自然晾干，室溫固定15～30 min，PBS洗滌3次，每次5 min。浸入封閉液中，室溫封閉10 min，PBS洗滌3次，每次5 min。浸入細(xì)胞膜通透液中，室溫靜置0.5～2 min，再進(jìn)行后續(xù)標(biāo)記反應(yīng)，標(biāo)記反應(yīng)需在濕盒中進(jìn)行操作。

將處理好的細(xì)胞爬片用PBS緩沖液漂洗后，濾紙吸去周圍液體，每個(gè)樣本滴加100 μl TdT酶反應(yīng)液，37 ℃避光孵育60 min。用1∶10稀釋的20×SSC溶液終止反應(yīng)，室溫靜置15 min，PBS洗滌3次，每次5 min。進(jìn)入0.3% HO/PBS中室溫封閉5 min，PBS洗滌3次，每次5 min；滴加100 μl Streptavidin-HRP工作液，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌3次，每次5 min。滴加DAB顯色液，去離子水沖洗數(shù)次后用中型樹膠封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

槐果堿處理A549細(xì)胞48 h后，取槐果堿處理組細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)液于離心管中，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，加入適量胰酶消化細(xì)胞，收集消化后細(xì)胞于離心管中并加入之前收集的細(xì)胞培養(yǎng)液。離心后棄上清液，收集細(xì)胞，用PBS緩沖液重懸并計(jì)數(shù)。每組分別取5×10個(gè)重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，加入流式細(xì)胞術(shù)緩沖液重懸各組細(xì)胞后，室溫避光孵育10 min，1 000 r/min離心5 min，再加入Annexin-FITC結(jié)合液及PI凋亡染色液試劑，輕輕混勻后冰浴避光孵育15 min，置于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡效率。

2 結(jié)果

2.1 槐果堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞作用48 h后IC

不同濃度(1、2、4、8、16、32、64 mmol/L)槐果堿處理肺癌細(xì)胞A549，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算IC，結(jié)果顯示，槐果堿對(duì)A549的IC為5.196 mmol/L(圖1)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)槐果堿給藥濃度為5 mmol/L。

圖1 MTT檢測(cè)槐果堿對(duì)A549的IC50

2.2 槐果堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞的增殖作用的影響

克隆形成和BrdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5 mmol/L槐果堿處理的槐果堿組肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞增殖低于對(duì)照組(圖2A，

t

=9.333；圖2B，

t

=10.530，

P

<0.05)，Western blot結(jié)果顯示，槐果堿組PCNA和MYC蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2C，

P

<0.05)。

圖2 槐果堿對(duì)肺癌增殖的影響

2.3 槐果堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞的凋亡作用的影響

TUNEL和流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5 mmol/L槐果堿處理的槐果堿組肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組(圖3A，

t

=6.884；圖3B，

t

=5.676，

P

<0.05)，Western blot結(jié)果顯示，槐果堿組Bax蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，Bcl-2蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3C，

P

<0.05)。

圖3 槐果堿促進(jìn)肺癌凋亡

2.4 槐果堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞PGD2/PTGDR2通路的影響

Western blot結(jié)果顯示，5 mmol/L槐果堿處理的槐果堿組肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞L-PTGDS和PTGDR2蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4，

P

<0.05)。

圖4 槐果堿激活PGD2/PTGDR2通路

2.5 激活PGD2/PTGDR2通路對(duì)肺癌A549細(xì)胞的影響情況

PGD2組給與5 ng/ml PGD2激活劑處理，與對(duì)照組比較，PGD2組L-PTGDS和PTGDR2蛋白表達(dá)顯著升高(圖5A)，細(xì)胞增殖受到抑制(圖5B)，凋亡增加(圖5C)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。

圖5 激活PGD2/PTGDR2通路抑制肺癌發(fā)生

3 討論

槐果堿作為傳統(tǒng)中藥苦參的活性成分，近期研究顯示其具有抑制腫瘤增殖、抗腫瘤浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等重要作用，在一定的濃度范圍內(nèi)槐果堿可激活細(xì)胞凋亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此，該研究重點(diǎn)研究A549肺癌細(xì)胞在給予槐果堿處理后其細(xì)胞增殖和凋亡情況的變化，通過克隆形成實(shí)驗(yàn)、BrdU實(shí)驗(yàn)、TUNEL實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)表明槐果堿能有效抑制A549細(xì)胞增殖并促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

PCNA只存在于正常的增殖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，是研究腫瘤細(xì)胞增殖活性的一種重要標(biāo)志物，PCNA是DNA聚合酶的一種輔助因子，主要在S期和G期合成，其表達(dá)和細(xì)胞的增殖程度緊密相關(guān)，相關(guān)研究表明PCNA表達(dá)與腫瘤的病理分型和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)關(guān)系。MYC是一種重要的原癌基因，在大多數(shù)人類癌癥中表達(dá)量升高，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。MYC在正常細(xì)胞中可參與調(diào)控維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、阻止細(xì)胞分化等多個(gè)過程，但在腫瘤細(xì)胞中MYC被異常激活，調(diào)控機(jī)制發(fā)生異常，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡及增殖異常，據(jù)報(bào)道MYC可通過影響腫瘤干細(xì)胞的分化和促進(jìn)血管生成來干擾腫瘤細(xì)胞的凋亡。該研究表明槐果堿作用于A549細(xì)胞后PCNA和MYC蛋白表達(dá)量顯著降低，表明槐果堿可抑制肺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。

Bcl-2家族蛋白分為細(xì)胞凋亡抑制劑和凋亡促進(jìn)劑2類，在調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Bax蛋白和Bcl-2蛋白是Bcl-2家族的主要成員。Bcl-2蛋白一般位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜的胞質(zhì)側(cè)，可通過抑制谷胱甘肽(GSH)外泄，降低細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用。Bax蛋白生物學(xué)功能與Bcl-2蛋白相反，其可通過與Bcl-2結(jié)合從而抑制Bcl-2蛋白的抗凋亡作用。該研究表明槐果堿作用于A549細(xì)胞后，Bax表達(dá)水平明顯升高而Bcl-2表達(dá)水平則受到明顯抑制，研究表明槐果堿可參與調(diào)控Bcl-2家族蛋白從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。

Zhang et al研究表明前列腺素D2(PGD2)與其受體(PTGDR2)之間的信號(hào)通路對(duì)胃癌具有抗腫瘤作用，在體外可抑制腫瘤細(xì)胞的自我更新，在體內(nèi)能夠抑制腫瘤的增長和轉(zhuǎn)移。研究表明，腫瘤組織中PTGDR2和PGD2合成酶(L-PTGDS)的表達(dá)水平顯著低于鄰近正常組織，且腫瘤組織中PTGDR2和L-PTGDS的表達(dá)水平與腫瘤干細(xì)胞(CSC)標(biāo)志物Sall和Lgr5呈負(fù)相關(guān)。在CSC中敲低PTGDR2和L-PTGDS的表達(dá)可導(dǎo)致CSC標(biāo)志物表達(dá)量增加，自我更新能力增強(qiáng)，過表達(dá)L-PTGDS或直接刺激PGD2可導(dǎo)致相反的效應(yīng)。此外，Zhang et al研究表明PGD2/PTGDR2信號(hào)通路是通過抑制STAT3基因的激活來抑制JAK/STAT3信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞的作用。該研究中Western blot實(shí)驗(yàn)表明對(duì)照組A549細(xì)胞中L-PTGDS和PTGDR2表達(dá)量顯著降低，槐果堿組細(xì)胞中L-PTGDS和PTGDR2表達(dá)量顯著增加，表明槐果堿能夠激活PGD2/PTGDR2信號(hào)通路。且給予PGD2激活劑處理后，與對(duì)照組細(xì)胞相比，PGD2組細(xì)胞的增殖受到抑制，細(xì)胞凋亡則顯著增加，表明槐果堿可通過激活PGD2/PTGDR2信號(hào)通路來抑制A549肺癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡，進(jìn)而抑制肺癌的發(fā)生。