利用GFP標記研究秸稈還田對假單胞菌PW9土壤定殖能力的影響

吳紅艷，于 淼，馮 健，馮 敏

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122000)

【研究意義】土壤是農業可持續發展的物質基礎，是作物生長的重要營養源泉，磷是植物生長必需的營養元素之一，磷的缺乏會影響植物光合作用、呼吸作用及生物合成過程，導致植物發生形態和生理上的變化。自然界中磷礦資源非常有限，土壤礦物通常對磷素具有強烈的固定和吸附作用，使土壤中95%以上的磷成為無效態，導致土壤磷素的植物有效利用率普遍較低。因此，利用生物技術手段，通過選育溶磷微生物來提高土壤磷的植物有效性成為刻不容緩的一個研究主題[1]。秸稈還田能夠增加土壤有機質及養分，提高土壤綜合效應，是當今普遍重視的一項培肥地力最終達到增產目的的有效措施。然而在秸稈還田的同時也會將秸稈中攜帶的多種微生物帶入土壤中，同時也可能會使土壤的理化性質等指標發生改變[2]。經過大量研究表明，溶磷微生物施入土壤后在生存過程中會受到土著微生物群系和外來微生物等諸多因素的影響[3]。因此，提高溶磷微生物在土壤中的定殖能力尤為重要?！厩叭搜芯窟M展】外源菌施入土壤后，用傳統的方法或抗生素標記法都不易將其與同類的土著微生物區分開，不易對其土壤和環境行為進行直觀、快速、高效的檢測，對靶標的作用等行為的動態研究成為盲區。因而，標記基因技術的建立與發展，為微生物定殖的微生態學研究提供了有效手段[4-5]。綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)最早于1962年在維多利亞多管水母中被發現，1994年首次在大腸桿菌細胞和線蟲中被表達。由于其熒光性能穩定、檢測方便、靈敏度高且表達不受種屬限制等特性，越來越為人們重視。磷細菌PW9是由遼寧省微生物科學研究自行分離篩選的菌種，初步鑒定為假單胞菌(Pseudomonas)，田間試驗結果表明施用磷細菌PW9可大幅度增加作物產量?！颈狙芯壳腥朦c】本研究利用綠色熒光標記系統與傳統的微生物群落分析技術相結合的方法，研究秸稈還田對假單胞菌PW9定殖能力的影響?！緮M解決的關鍵問題】此結果將為解磷菌合理施用及微生物菌肥與秸稈還田協同作用的深入研究奠定了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株與質粒：假單胞菌PW9為短桿菌，革蘭氏陰性，由本研究室從番茄植株根系土壤中分離；質粒pBBR1MCS2-Tac-EGFP具有卡那霉素抗性，目的基因片段大小為789 bp，由淼靈質粒平臺提供(圖1)。

圖1 質粒pBBR1MCS2-Tac-EGFP

儀器設備：Eporator電轉儀，HZQ-Q全溫振蕩器(哈爾濱東聯電子技術開發有限公司)，ZQ中器生化培養箱，SiGMA 3K15高速低溫冷凍離心機，ZF1-Ⅱ型紫外透射反射分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)。培養基與培養條件：DH5α與假單胞菌PW9菌株均采用LB培養基，分別于37和30 ℃下培養。在對菌株進行解磷能力測試時使用PVK培養基30 ℃下培養?？股丶笆褂脻舛龋嚎敲顾?Kan)為50 μg/mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 質粒pBBR1MCS2-Tac-EGFP提取及檢測 參照分子克隆中質粒的小量制備——SDS堿裂解法。

1.2.2 出發菌株WP9感受態細胞的制備 滅菌牙簽挑取單菌落于LB中，30 ℃培養至OD600接近于0.4時收集培養液冰浴1 h，10 000 r/min離心5 min，收集菌體加入預冷的ddH2O洗滌菌體，重復此步驟3次，將感受態細胞溶解于10%(V/V)甘油中并分裝，-70 ℃保存備用。

1.2.3 電轉化 取感受態細胞100 μL 與電擊杯一起放在冰上冷卻，加入5 μL質粒置于冰上60 s，調節電轉儀電壓為2.5 KV進行電擊轉化[6]，于轉化后細胞加入1 mL LB液體培養基轉移至Ep中，37 ℃輕柔振蕩1 h，轉移至含有濃度為50 μg/mL卡那霉素(Kan)的抗生素平板，30 ℃恒溫培養。

1.2.4 轉化子的篩選鑒定 將1.2.3獲得的抗生素平板上生長的轉化子，無菌牙簽挑取后接入含有卡那霉素的LB液體培養基中，30 ℃ 200 r/min振蕩培養24 h，培養液提取質粒并進行酶切鑒定(表1)。

表1 質粒酶切體系

1.2.5 標記菌株解磷能力測試 利用鉬銻抗比色法對出發菌株和標記菌株進行解磷能力測試。分別將其活化后按1%接種量接入PVK液體培養基中30 ℃培養7 d，每天取樣1次進行解磷能力測試，并比較分析。

1.2.6 質粒熒光檢測與穩定性考察 熒光檢測：利用紫外分析儀365 nm反射光對菌落綠色熒光進行觀察。質粒穩定性考察：挑取標記菌株PW9-gfp單菌落接種于無抗生素(卡那霉素)LB液體培養基中活化過夜,按0.1% 接種量接種于無抗生素的液體LB培養基中，30 ℃ 200 r/min振蕩培養5 h，再取樣以相同接種量，培養條件相同，如此重復培養50 h，涂布無抗生素LB平板上，30 ℃恒溫培養48 h，然后隨機選取300個克隆轉入含50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，30 ℃ 培養72 h，觀察菌落生長情況，以抗性菌株所占百分比來計算菌株質粒的遺傳穩定性。

1.2.7 標記菌株PW9-gfp在土壤中的定殖能力研究 選擇大田土壤，過10目篩，pH7.3，速效P為15 mg/L。試驗設計為無秸稈粉只接入PW9-gfp，加入秸稈粉并接入PW9-gfp 2個處理。每個處理稱取500 g土壤于小花盆中，栽入番茄苗，澆水100 mL水，定殖1周時按1%接菌量接入PW9-gfp菌懸液，各處理3次重復，每隔10 d取樣1次(取樣方法：去除表層1 cm土壤及雜質，取植株根際土壤作為試驗樣品，試驗結果取每個處理3次重復的平均值)，按照平板稀釋涂布法，涂布于含50 μg/mL卡那霉素(Kan)的LB平板上，30 ℃恒溫培養72 h后記錄綠色熒光菌落數。

2 結果與分析

2.1 標記菌株的構建及質粒酶切檢測

由圖2可以看出，標記菌株1、2、3號中提取的質粒均與已知質粒pBBR1MCS2-Tac-EGFP的位置相同，6、7號出發菌株在同樣位置無質粒存在；3株標記菌株經過雙酶切后在大于750 bp小于1 kb的位置出現小片段(圖3)，即為已知克隆的gfp基因片段，由此可見，質粒pBBR1MCS2-Tac-EGFP已被成功轉化至菌株PW9中，即PW9-gfp。

1、2、3號為PW9-gfp；4、5號為pBBR1MCS2-Tac-EGFP；6、7號為PW9;M為標準RealBand 10 kb DNA

1、2、3為PW9-gfp質粒;1-1、2-1、3-1為PW9-gfp質粒酶切樣品;M為標準Real Band 10 kb DNA

2.2 標記菌株與出發菌株解磷能力測試

圖4可以看出，出發菌株和3株標記菌株培養液中有效磷含量在培養第4，5天 最高，之后平穩下降[7-8]，出發菌株在第4天時最高達到352.3 mg/L，標記菌株1號在第4天時達到最高，達到360.9 mg/L，標記菌株2號在第4天達到最高為325.8 mg/L，標記菌株3號在第5天達到最高為332.7 mg/L。因而，由于3株標記菌株中1號有效磷含量相對較高，達到最高點的時間相對較短，說明分解不溶性磷的能力相對較強，因而，選擇1號標記菌株作為定殖能力相關研究的試驗菌株。

圖4 出發菌株與標記菌株培養液中有效磷含量

2.3 標記菌株PW9-gfp菌落熒光檢測

由圖5可以看出，由于質粒pBBR1MCS2-Tac-EGFP轉化至假單胞菌PW9后，在含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上置30 ℃恒溫培養72 h時顯現強烈的表達效果，可以清楚觀察到綠色熒光蛋白的顯著特征。

圖5 標記菌株PW9-gfp菌落熒光檢測

2.4 標記菌株PW9-gfp質粒穩定性研究

由圖6可以看出，隨著菌落生長代數的增加質粒穩定性下降。在菌株生長5 h時穩定性為100%，10 h時穩定性為99.8%，直到50 h時穩定性仍然高達91.2%。研究表明，一般實驗室條件下桿菌分裂一代需要20～30 min，在土壤中分裂一代需要時間為50～100 h[9],以此計算標記菌株PW9-gfp質粒至少在120 d內穩定，完全可以用于后續研究。

圖6 標記菌株PW9-gfp質粒穩定性

2.5 標記菌株PW9-gfp在土壤中的定殖能力

由圖7可以看出，標記菌株PW9-gfp單獨施入和秸稈同時施入的土壤樣品中有效菌落數量1 g(cfu/g)隨著作物生長時間的增加逐漸減少，兩者在10 d到20 d之間下降幅度較小，20 d的時候開始急速下降，在作物生長60 d過程中兩者均由初始1.1×109降至十位數，分析減少的的原因，可能是由于試驗使用的是大田土壤，土壤中豐富的土著微生物群落定殖和生長更具有優勢，所以在一定時間內會影響到外界施入的標記菌株PW9-gfp競爭力。另外，從兩個處理的0～60 d之間菌落數量總體趨勢看，有秸稈施入的土壤樣品有效菌落數量均略高于無秸稈施入的土壤樣品。分析原因，秸稈施入后土壤的組成如有機質、菌群等成分有一定的改變，以至于對標記菌株PW9-gfp菌落生長速度會有一定的積極作用。且標記菌株PW9-gfp是施于植物根部的，與植物根系之間具有相互作用的關系，微生物在根際土壤定殖是個十分復雜的過程，會受到很多因素的影響，因而，秸稈還田是否對菌株PW9的土壤定殖能力具有一定的促進作用，其作用機理有待進一步研究。

圖7 標記菌株PW9-gfp在土壤中的定殖能力測試

3 討 論

秸稈還田是當今世界上普遍重視的一項培肥地力的增產措施，不僅杜絕了秸稈焚燒時所造成的空氣污染，還可以改善土壤結構和土壤環境，促進微生物活力和作物根系的發育，改良土壤，最終達到增產增收目的，因而受到國內外眾多學者的普遍關注。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein)，簡稱GFP最早是由下村修等人在1962年在維多利亞多管發光水母(Aequoreavictoria)中發現，其基因所產生的蛋白質，在藍色波長范圍的光線激發下，會發出綠色熒光[10-11]，可用長波紫外燈甚至肉眼簡單、直接、方便地對標記體進行定性檢測，不受環境與基因表達與否的限制，多態性高，具有良好的遺傳穩定性，目前成為研究熱點。

4 結 論

本研究利用GFP標記系統對解磷菌PW9進行了標記并對其標記后質粒穩定性進行了研究，結果表明質粒在土壤中至少120 d內是穩定的。將標記菌株PW9-gfp與秸稈同時施入土壤，通過測試植株根際土壤有效菌群的數量并分析，結果表明，在施入標記菌株PW9-gfp 10～20 d時有效菌落數量為最高，此時定殖能力為最強，保持一段時間后開始下降,但仍然可以定殖，說明標記菌株PW9-gfp可以作為研究解磷菌PW9定殖能力的材料。而標記菌株PW9-gfp與秸稈粉一起施入的土壤樣品，有效菌群數量在不同取樣時間均略高于單獨施入處理，表明秸稈施入的行為對于解磷菌PW9的定殖能力有一定的促進作用，分析原因，可能是由于秸稈中含有豐富的有機質、纖維素、糖類等營養成分并攜帶種類繁多的微生物與同時施入的解磷菌PW9-gfp相互協同作用，達到了增強其定殖能力的效果[12]，其作用機制還需進一步研究，這一結果為今后解磷菌合理施用及微生物菌肥與秸稈還田協同作用的深入研究奠定了一定的理論基礎。