嗜水氣單胞菌外膜蛋白OmpK的原核表達、抗原性分析及抗血漿殺菌作用研究

榮 娜，康 超，孫 薇，簡思杰，伍娜娜，劉 祥

(陜西理工大學生物科學與工程學院，中德天然產物研究所，陜西 漢中 723001)

【研究意義】嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)為革蘭氏陰性短桿菌，是一種條件性病原菌[1]，主要感染淡水魚類，引發局部出血和敗血癥[2-3]，給漁業生產造成巨大經濟損失。此外，人類的腦膜炎、胃腸炎和敗血癥等疾病也和此菌有關[4]。嗜水氣單胞菌疾病傳統上是用抗生素控制，但長期使用會導致機體藥物殘留和菌株耐藥性等問題[5-6]。疫苗接種作為一種有效策略，已經在大規模商業養殖中發揮了重要作用[7]，但目前還未研制出抗嗜水氣單胞菌感染的商用疫苗，大多研究主要集中于實驗室研發階段[8-9]。因此，開發嗜水氣單胞菌新型漁用疫苗至關重要。【前人研究進展】外膜蛋白(Outer membrane protein，OMP)是嗜水氣單胞菌的毒力因子之一[10]，位于細菌最外層，使得蛋白抗原表位暴露[11]，易被宿主識別為外來物質而激發免疫應答，在嗜水氣單胞菌感染的防治中具有重要作用。Khushiramani等[12]用純化的外膜蛋白OmpTS免疫鯉魚并制備了滴度較高的抗體，證實該蛋白在鯉魚體內具有高度的免疫原性。Maiti等[13]利用外膜蛋白OmpW在兔體內制備了抗重組蛋白的多克隆抗體，并證實了抗體的特異性反應。因此，嗜水氣單胞菌外膜蛋白有望成為疫苗開發的靶點。【本研究切入點】本研究選取嗜水氣單胞菌主要外膜蛋白OmpK為研究對象，對其進行生物信息學分析，分子克隆獲得OmpK蛋白的原核表達菌株，探討其最佳表達條件；純化獲得OmpK蛋白并制備小鼠抗血清；探究OmpK蛋白抵抗魚血漿殺菌的作用。【擬解決的關鍵問題】此研究結果為嗜水氣單胞菌OmpK蛋白功能研究與疫苗開發提供支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 實驗材料 嗜水氣單胞菌ATCC 7966、EscherichiacoliDH5α、E.coliBL21菌株及pET-32a質粒由陜西理工大學中德天然產物研究所保存；昆明鼠購自西安交通大學實驗動物中心。

1.1.2 實驗試劑Taq聚合酶、內切酶BamH Ι和XhoΙ、T4-DNA連接酶購自TaKaRa公司；細菌基因組提取、質粒提取試劑盒購自上海生工公司；IPTG購自西安沃爾森生物科技有限公司；TMB顯色液為西安赫特生物科技有限公司產品；山羊抗小鼠IgG二抗購于Sigma公司；引物合成、基因測序由天潤奧科生物公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學分析 查找并獲取不同菌株OmpK的蛋白序列，利用GeneDoc軟件和MEGA軟件分別進行OmpK同源性比對和系統發育分析；通過ProParam數據庫預測OmpK的等電點、親水性和半衰期等理化性質，并在ProScale analysis數據庫中獲取親水性圖譜；采用TMHMM 2.0和SignalP 5.0軟件預測OmpK的跨膜結構和信號肽區域，并通過SOPMA和SWISS-MODEL軟件預測OmpK的二級結構和三級結構。最后使用STRING軟件在線構建OmpK與其它蛋白的相互作用關系網絡。

1.2.2 重組質粒的構建 根據NCBI數據庫公布的嗜水氣單胞菌ATCC7966全基因組，設計引物擴增ompK基因。序列如下：Sense Primer: AAAGGAT CCATGGCCAAATTTACCAAGAC; Anti-sense Primer: AGCCTCGAGTTAGAACTTGTAGGTAAC(劃線位置分別為酶切位點BamH Ι和XhoⅠ)。以全基因組作為模板，利用Taq聚合酶擴增ompK基因，擴增體系為50 μL，退火溫度、延伸時間分別設定為55 ℃、1 min。PCR產物經0.8%的瓊脂糖凝膠鑒定后回收，使用BamH Ι 和XhoⅠ2種內切酶雙酶切質粒pET-32a與PCR產物，通過T4-DNA連接酶將ompK基因連接至質粒pET-32a，轉化E.coliDH5a中，獲得重組質粒。雙酶切和基因測序進一步鑒定重組質粒，將構建成功的重組質粒轉化至E.coliBL21中，進行OmpK蛋白外源表達。

1.2.3 重組蛋白的表達及純化 挑取表達菌單菌落培養12～16 h，以1∶100轉接至新的培養液中培養至OD600為0.6，加入0.1 mol/L的IPTG，搖床誘導6 h，收集1 mL菌液，菌體加入蛋白上樣緩沖液后于沸水中煮樣5 min，通過SDS-PAGE電泳檢測OmpK蛋白表達，結合包涵體洗滌和SDS-PAGE蛋白電泳切膠法純化OmpK蛋白。

1.2.4 重組蛋白表達條件的優化 采用L9(34)正交實驗模型(表1)探究OmpK蛋白最佳表達條件。主要步驟為：將過夜培養的OmpK表達菌液以1∶100比例接入600 mL培養液中，37 ℃、200 r/min培養至設定的OD600值，按照表中要求加入不同濃度的IPTG，每組進行3次重復。取1 mL誘導菌液，菌體加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min，樣品通過SDS-PAGE電泳獲得不同誘導條件下的OmpK蛋白表達圖譜。通過軟件Phoretix 1D和SPSS分別對表達圖譜光密度和不同因子作以顯著性分析。

1.2.5 蛋白小鼠抗血清的制備及特異性檢測 選用20 g左右昆明鼠，實驗前飼養3 d，實驗組和對照組各10只。取100 μg純化的OmpK蛋白與100 μL弗氏完全佐劑充分混合，腹腔注射免疫小鼠。14 d后，等量蛋白混合100 μL弗氏不完全佐劑，加強免疫小鼠。7 d后，進行第3次免疫，對照組免疫PBS。

1周后眼球取血，血液于4 ℃待血清自然析出后，3000 r/min離心10 min，收集抗血清于-80 ℃備用。

采用Western blot檢測OmpK抗血清的特異性，簡要過程如下：SDS-PAGE電泳嗜水氣單胞菌全蛋白，于80 V電壓下轉NC膜，NC膜在含5%脫脂牛奶的TNT緩沖液中充分封閉2 h后，與不同稀釋倍數(1∶400, 1∶800, 1∶1200, 1∶1600)的OmpK小鼠抗血清于室溫孵育90 min，對照為陰性抗血清。NC膜經洗滌后與二抗(1∶3000倍稀釋)于室溫孵育90 min，在DAB顯色液中充分顯色以檢測OmpK抗血清的特異性。

1.2.6 體外模擬蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌的相互作用 采用酶聯免疫法檢測OmpK抗血清與嗜水氣單胞菌的體外相互作用：培養嗜水氣單胞菌至OD600約1.0，菌體用1%的甲醛生理鹽水80 ℃滅活90 min，生理鹽水調整菌液OD600為0.2，分裝為1 mL/管(菌量108cfu)。取100 μL不同稀釋倍數的OmpK抗血清(1∶400, 1∶800, 1∶1600, 1∶3200, 1∶6400)與小管菌體于室溫輕搖孵育90 min，對照為陰性血清。菌體再與200 μL的二抗(1∶3000倍稀釋)孵育1 h，用20 μL PBS重懸菌體并轉移至酶標板中，加入200 μL TMB顯色液，避光充分顯色10 min，加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應，450 nm處測定吸光值。

1.2.7 蛋白抵抗血漿殺菌作用 培養嗜水氣單胞菌12～16 h，以1∶100比例接入100 mL新的培養液，培養至OD600為0.5，菌體用0.85%生理鹽水洗滌并調整OD600為1.0，分裝為1 mL/管，小管菌體分別與600 μL不同稀釋倍數的魚血漿(未稀釋血漿、1∶2, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32)于28 ℃，200 r/min孵育5 h，對照為生理鹽水。洗滌菌體3次，SDS-PAGE分離全菌蛋白并轉NC膜，NC膜充分封閉后依次與一抗、二抗孵育，采用DAB顯色法進行顯色，通過觀察特異性條帶的亮度分析OmpK蛋白的差異表達，評價其抵抗血漿殺菌的作用。

2 結果與分析

2.1 生物信息學分析

2.1.1 OmpK蛋白的同源性與系統發育分析 利用GeneDoc軟件繪制氣單胞菌屬間不同菌株的OmpK蛋白氨基酸序列同源比對圖(圖1)，氣單胞菌屬間不同菌株OmpK蛋白同源性均較高。使用MEGA軟件進行系統發育分析(圖2)，發現不同種類的氣單胞菌間進化關系較近，其中嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和中間氣單胞菌3種菌株親緣關系更為緊密。因此，推測OmpK蛋白可能為不同種類的氣單胞菌提供交叉免疫保護作用。

圖2 OmpK系統發育樹

2.1.2 OmpK理化性質、結構與功能預測 ProtParam數據庫分析顯示：OmpK含有280個氨基酸，分子量大小為32061.57，等電點為5.08，半衰期大于10 h，不穩定指數為27.40，屬于穩定蛋白；親水性圖譜分析顯示氨基酸最大分值為0.011，最小為-2.010，親水性平均值為-0.430，表明OmpK為親水性蛋白(圖3-A)；由跨膜結構預測圖譜(圖3-B)可知，7～30位氨基酸形成一個可信度較高的跨膜區域；信號肽預測結果(圖3-C)顯示，該蛋白的信號肽組成序列為1～23位氨基酸，23～24位氨基酸之間存在切割位點，可信度達到0.9444；SOPMA軟件二級結構預測顯示，α-螺旋占全序列18.57%，延伸鏈占33.93%，無規則卷曲占47.50%(圖3-D)。SWISS-MODEL軟件三級結構預測結果顯示，OmpK蛋白的的三維結構呈現為桶狀(圖3-E)；通過STRING數據庫構建蛋白互作網絡，發現僅有gpt與AHA-1131 2種蛋白與OmpK存在直接作用(圖3-F)。

A：親水性預測；B：跨膜結構預測；C：信號肽預測；D：二級結構預測；E：三級結構預測；F：蛋白互作網絡

2.2 OmpK重組菌株的構建

以全基因組為模板，利用上下游引物擴增ompK基因，電泳檢測顯示約在843 bp處有目標條帶存在(圖4-A)，大小與ompK基因相一致。重組質粒pET-32a-ompK經BamH Ι和XhoⅠ雙酶切，得到約843 bp的目標條帶，符合理論大小(圖4-B)。目的基因經測序比對，顯示與NCBI公布的ompK基因序列一致，表明成功構建重組質粒，轉化至E.coliBL21獲得OmpK重組表達菌株。

A：PCR擴增ompK基因；B：重組質粒的雙酶切；M：DNA marker；1：ompK基因；2：重組質粒pET-32a-ompK；3：Bam H Ι和Xho Ⅰ雙酶切

2.3 OmpK蛋白的表達純化

OmpK重組菌株經IPTG誘導表達，電泳顯示目標蛋白成功表達，分子量大小約51 kDa；利用包涵體洗滌和SDS-PAGE電泳切膠法純化獲得OmpK蛋白(圖5)。

M：蛋白marker；1：未誘導菌株；2：誘導菌株；3：純化的OmpK蛋白

2.4 OmpK蛋白最佳表達條件的優化

為確定OmpK蛋白的最佳表達條件，每個條件組合進行3組重復。誘導菌液經SDS-PAGE電泳獲得不同誘導條件下的蛋白表達圖譜(圖6)，從表3可得出，OmpK菌株最佳表達條件組合為A3B3C3D2，即在菌液濃度達到OD600=1.0時，選擇終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，于28 ℃誘導8 h。由表4表明，在OmpK蛋白誘導表達時，誘導劑IPTG濃度達到顯著性，因此，適度的誘導劑濃度對于OmpK蛋白的高效表達尤為重要。

表2 OmpK蛋白表達圖譜光密度分析

表3 OmpK光密度數值的極差分析

表4 OmpK光密度數值的方差分析

A，B，C為3次重復；M：蛋白marker；1：未誘導菌株；2～4：OD600值為0.5，誘導溫度分別為28，32，37 ℃：5～7：OD600值為0.8，誘導溫度分別為28，32，37 ℃；8～10：OD600值為1.0，誘導溫度分別為28，32，37 ℃

2.5 OmpK蛋白抗血清的特異性與效價檢測

Western blot驗證OmpK蛋白抗血清特異性，結果顯示在約31 KDa處出現特異性條帶，陰性對照無條帶，表明OmpK蛋白抗血清具有良好的特異性且抗血清效價達到1∶1600(圖7)。

M：蛋白marker；1～4：抗血清稀釋倍數分別為為1∶400，1∶800，1∶1200，1∶1600；5: 陰性血清(1∶400倍稀釋)

2.6 體外模擬OmpK蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌相互作用

由圖8顯示，隨著抗血清稀釋倍數的增大，OmpK蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌的結合能力逐漸減弱，當抗體滴度達到1∶3200時，仍可檢測到兩者的相互作用。由此可見，OmpK蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌在體外存在相互作用，OmpK蛋白可能存在較好的抗原性。

圖8 OmpK蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌體外相互作用

2.7 OmpK蛋白抵抗魚血漿的殺菌作用

采用Western blot檢測OmpK的差異表達情況(圖9)。實驗組與對照組OmpK蛋白均檢測到特異性條帶，且隨著血漿濃度的降低OmpK的表達呈現出上調趨勢，推測OmpK可能為孔道蛋白，通過關閉孔道，以有效抵抗血漿殺菌因子進入細胞而殺傷菌體。

1～5：血漿稀釋倍為1∶2, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32；6：未稀釋血漿；7：陽性對照(生理鹽水)

3 討 論

嗜水氣單胞菌是一種廣泛存在的病原體，對人和動物均有致病性[14]，主要可引發魚類的氣單胞菌敗血癥，也可導致人類胃腸炎和皮膚感染。在該菌的防治方面，以往的抗生素手段療效好，但極易引起機體耐藥性[6,15]。疫苗免疫作為一種安全且無毒害的防治手段[16]，備受青睞。目前處于研究熱點的漁用疫苗包括亞單位疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗等[17]。其中亞單位疫苗是以免疫活性的片段作為組分，免疫作用穩定持久，是一種潛在的高效疫苗[18]，而嗜水氣單胞菌的外膜蛋白具有較強的免疫原性[19]，可作為疫苗開發的候選成分。本研究構建了的嗜水氣單胞菌OmpK蛋白表達菌株，制備了OmpK蛋白多克隆抗體，為疫苗研發奠定基礎。

生物信息學可準確預測蛋白質親緣關系、理化性質及高級結構等[20]。本研究發現OmpK蛋白在氣單胞菌屬間同源性較高，表明OmpK蛋白在不同種類的氣單胞菌間所參與的耐藥機制可能相近；OmpK免疫機體產生的抗體，可能同時抵御多種氣單胞菌的感染。二級結構以無規則卷曲為主(47.50%)，因其易扭曲盤旋，暴露在蛋白外層，有利于優勢細胞抗原表位的形成[21]，為研發廣譜性OmpK蛋白疫苗制劑提供理論依據。

多克隆抗體制備周期短且效果好，常應用于蛋白的免疫功能研究[22]。本研究以純化的蛋白免疫小鼠制備了特異性較好的OmpK蛋白多克隆抗體，且抗體效價達到1∶1600倍，為嗜水氣單胞菌OmpK蛋白的功能研究與疫苗開發提供良好的生物學基礎材料。

蛋白的外源表達由于受到宿主的影響，其最佳表達條件往往是唯一的，實驗發現菌液OD600為1.0，IPTG終濃度為0.5 mmol/L，28 ℃誘導8 h，OmpK蛋白獲得最大表達。研究發現，高濃度的IPTG和長時間誘導會抑制細菌生長，影響蛋白表達[23-24]，與本實驗發現低濃度IPTG(0.5 mmol/L)，8 h誘導一致；此外，低溫誘導利于活性蛋白的表達，可有效降低包涵體產生[25]，本研究也發現低溫(28 ℃)更有助于OmpK表達，為工業大量獲取OmpK蛋白提供參考依據。

體外模擬OmpK蛋白多克隆抗體與嗜水氣單胞菌的識別作用，結果顯示兩者在體外存在相互作用，表明獲得了特異性較好的OmpK蛋白多克隆抗體。細菌在機體內被清除往往需要有相應的抗體與其互相識別[26]，本研究在體外模擬蛋白抵抗魚血漿殺菌作用，發現細菌進入魚體后，OmpK呈現為下調表達量，推測OmpK蛋白可能為孔道蛋白，通過關閉通道以抵抗血漿因子識別，從而保護細菌，這也與所預測的三維結構為桶狀相吻合。有研究發現大腸桿菌外膜蛋白TolC攜帶外排基因，屬于外排泵蛋白，表現為上升表達量以抵抗藥物作用[27]，這與本研究中OmpK蛋白呈現的下調機制恰好相反，本研究為揭示相關疾病的發生機理奠定基礎。

4 結 論

OmpK在氣單胞菌屬間蛋白同源性較高，可能在多種氣單胞菌間具有免疫保護作用；并獲得其理化性質和形態結構。成功表達并純化OmpK蛋白，獲得其最佳表達條件，制備了特異性較好的OmpK多克隆抗體，效價達到1∶3200，OmpK抗血清對嗜水氣單胞菌具有較好的免疫識別作用，具有較好的抗原性；OmpK可通過下調表達實現抵抗魚血漿對嗜水氣單胞菌的殺菌作用，為嗜水氣單胞菌OmpK蛋白的生物學功能提供理論支持。