利用分子標(biāo)記輔助選擇聚合水稻Pi-ta，Pi-b和Pi-9基因

劉 凱，宛柏杰，趙紹路，朱靜雯,張桂云，代金英,嚴(yán)國紅，王愛民，朱國永，唐紅生，孫明法

(江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 江蘇 鹽城 224002)

【研究意義】由稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)引起的水稻稻瘟病是水稻三大病害之一[1]，在全球不同的水稻種植區(qū)域均有發(fā)生，使水稻產(chǎn)量大幅降低，嚴(yán)重時甚至顆粒無收[2]。在過去20年，稻瘟病病害呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢。因而，預(yù)防稻瘟病和降低稻瘟病的發(fā)病率，尤其是穗頸瘟的防治，對于我國乃至全世界糧食安全都具有極其重要的意義[3]。目前生產(chǎn)上所用的抗稻瘟病水稻品種比較單一，而且有效抗源稀少，伴隨稻瘟病病菌優(yōu)勢生理小種的嚴(yán)重退化，抗性很快就會喪失，新培育的水稻品種在連續(xù)種植多年后就可能成為感病品種[4]。而通過基因聚合，選育水稻抗稻瘟病新品種是目前防治水稻稻瘟病最有效的方式。【前人研究進(jìn)展】近年來,國內(nèi)外研究者利用不同的方法，定位和克隆了約180多個水稻稻瘟病抗性基因(QTL)，廣泛分布在水稻12條不同的染色體上。據(jù)報道，時克等[5]認(rèn)為稻瘟病抗性基因Pi-tα和Pi-b在我國水稻種植區(qū)域內(nèi)具有良好的抗性，已廣泛被水稻育種家應(yīng)用于實踐當(dāng)中。此外，Pi-9基因的廣譜抗性對水稻抗稻瘟病也具有重要價值，建議在實際生產(chǎn)中大力推廣種植攜帶有Pi-9的水稻抗性品種[6]。Pi-ta基因來源于秈稻品種，與Pi-b基因是水稻中最早被克隆的2個稻瘟病主效基因，定位于BAC克隆BAC142E8上[7]。通過與無毒稻瘟病菌基因AVR-Pi-ta發(fā)生互作，引發(fā)抗病反應(yīng)[8]。在江蘇粳稻種植區(qū)域，Pi-ta基因已經(jīng)被廣泛用于稻瘟病抗性育種中[9]。Pi-b基因位于水稻第2染色體長臂上，屬于NBS-LRR(Nucleotide Binding Site-Leucine Rich Repeat)基因家族，編碼1251個氨基酸組成的多肽，在細(xì)胞質(zhì)中與無毒基因產(chǎn)物結(jié)合，從而誘發(fā)水稻植株體內(nèi)產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)[10]。Pi-9源自于野生稻(Oryzaminuta)，該基因含有6個串聯(lián)排列的NBS-LRR基因[11]。Pi-9具有廣譜抗性，接種鑒定表明對40多個稻瘟病菌株都有很好的抗性[12]，與Pi2、Pi-z、Pigm及Pi-zt等互為等位基因，Pi-9的廣譜抗病性可能是由于其能夠識別不同稻瘟病病菌生理小種。【本研究切入點(diǎn)】本研究以攜帶稻瘟病抗性基因Pi-9的水稻品種‘鹽稻10號’為母本，以同時攜帶稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的水稻品種‘武運(yùn)粳8號’為父本雜交進(jìn)行聚合育種。利用分子標(biāo)記輔助選擇，成功將Pi-ta，Pi-b和Pi-9基因聚合于一體，選育出抗稻瘟病、產(chǎn)量高，米質(zhì)優(yōu)的水稻新品系‘鹽稻1626’。【擬解決的關(guān)鍵問題】成功選育3個稻瘟病抗性基因聚為一體的水稻新品系，為水稻稻瘟病抗性育種創(chuàng)制了新的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的水稻品種‘鹽稻10號’(蘇審稻200909，攜帶稻瘟病抗性基因Pi-9)，江蘇省武進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的‘武運(yùn)粳8號’(攜帶稻瘟病抗性基因Pi-ta，Pi-b)，以及鹽稻10號/武運(yùn)粳8號配置的雜交種，以及F2、F3、F4、F5自交后代，用于稻瘟病分子標(biāo)記檢測的F5代家系編號為YC1-YC32。

1.2 材料種植

所有試驗材料2012-2017種植于江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所鹽城南洋試驗農(nóng)場以及海南三亞基地，鹽城5月10號播種，6月10號栽插，三亞12月15日播種，1月10日栽插，采用單本寬窄行栽培，常規(guī)粳稻株行距30 cm×12 cm，田間常規(guī)管理，成熟后收割、拷種。

1.3 稻瘟病抗性鑒定

供試菌株由江蘇省農(nóng)科院植物保護(hù)研究所提供，接種方法參照農(nóng)業(yè)部發(fā)布的水稻品種試驗稻瘟病抗性鑒定與評價技術(shù)規(guī)程見表1，接種后30 d進(jìn)行病情調(diào)查[13]。

表1 稻瘟病鑒定標(biāo)準(zhǔn)

1.4 DNA提取和PCR擴(kuò)增檢測

稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b和Pi-9的PCR特異性引物信息見表2，由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用CTAB法提取DNA，PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20 μl，包括：目的DNA 2 μl，TaqMix 10 μl，前后引物各0.5 μl，ddH2O 7.0 μl。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；共35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增片段在1 %瓊脂糖凝膠上電泳分離，紫外凝膠成像儀上觀察、拍照。

表2 稻瘟病抗病基因檢測引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性基因PCR擴(kuò)增檢測

利用各抗病基因的特異性引物對F5代選育的32個水稻品系進(jìn)行PCR檢測。12個水稻株系成功擴(kuò)增1042 bp的條帶(圖1～3)，分別為YC1-YC12，表明其中含有Pi-ta抗病基因，出現(xiàn)頻率為37.5 %；21個品系擴(kuò)增出365 bp的條帶，分別為YC1-4、YC6-8、YC10-11、YC13、YC16-24、YC26-27、YC32，含有Pi-b抗性基因，出現(xiàn)頻率為65.6 %，4個品系擴(kuò)增出500 bp的條帶，表明含有Pi-9抗性基因，出現(xiàn)頻率為12.5 %。聚合2個抗性基因的品系合計有8個品系，占所有待測材料數(shù)量的25 %，聚合3個抗性基因的只有一個品系，為YC3，這表明已成功獲得含有Pi-ta、Pi-b和Pi-9的水稻穩(wěn)定品系。

2.2 聚合基因株系稻瘟病接種鑒定

同時，鹽城正季在江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所南洋試驗農(nóng)場對選育的32個水稻F5株系進(jìn)行穗頸瘟人工接種鑒定，達(dá)到中抗(病級為3級)的材料有12份、中感(病級為5級)4份、感(病級為7級)12份(表3)，高感(病級為9級)4份。其中聚合2個以上抗性基因的，無論是Pi-ta+Pi-b、Pi-b+Pi-9及Pi-ta+Pi-b+Pi-9，稻瘟病接種鑒定都表現(xiàn)為中抗，達(dá)到3級水平，這表明聚合抗性基因顯著提高了水稻稻瘟病的抗性。當(dāng)Pi-ta單獨(dú)存在時的抗性效應(yīng)不顯著，抗性水平為5級，Pi-b單獨(dú)存在時間，抗性水平為7級，而兩者聚合以后抗性得到顯著的提高，達(dá)到中抗水平，同時聚合3個抗性的水稻品系抗性同樣也達(dá)到中抗水平以上。這一結(jié)果與朱勇良等[17]認(rèn)為以Pi-ta為代表的一些抗性基因?qū)K粳稻的穗頸瘟抗性正在逐漸喪失的結(jié)論相近。

表3 F5株系稻瘟病接種鑒定與基因檢測結(jié)果

2.3 品種選育過程

2012年夏，在江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所南洋試驗農(nóng)場，用鹽稻10號與武運(yùn)粳8號雜交配組，選育過程如圖4。

2.4 抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)水稻新品系‘鹽稻1626’的農(nóng)藝性狀

‘鹽稻1626’來源于鹽稻10號×武運(yùn)粳8號雜交后代。2018年推薦參加中種集團(tuán)組織的國家黃淮海粳稻區(qū)域試驗。全生育期兩年區(qū)試平均151.5 d，比徐稻3號(CK)晚熟0.9 d。兩年區(qū)試平均產(chǎn)量10 024.8 kg/hm2，比徐稻3號(CK)增產(chǎn)3.03 %，增產(chǎn)點(diǎn)比例76.7 %。2019年生產(chǎn)試驗平均產(chǎn)量10 217.4 kg/hm2，比徐稻3號(CK)增產(chǎn)3.41 %，增產(chǎn)點(diǎn)比例77.8 %。

主要農(nóng)藝性狀兩年區(qū)試綜合表現(xiàn)：每667 m2有效穗22.2萬穗，株高88.7 cm，穗長15.5 cm，每穗總粒數(shù)138.1粒，結(jié)實率87.8 %，千粒重26.3 g。2018-2019年稻瘟病江蘇省農(nóng)科院植保所鑒定結(jié)果如表4，天津市農(nóng)科院鑒定結(jié)果如表5；條紋葉枯病5級。米質(zhì)理化指標(biāo)根據(jù)農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(武漢)檢測：糙米率85.0 %，整精米率71.8 %，長寬比1.7，堊白粒率17 %，堊白度4.3 %，透明度1級，堿消值7.0，膠稠度62 mm，直鏈淀粉含量15.0 %，達(dá)到農(nóng)業(yè)行業(yè)《食用稻品種品質(zhì)》標(biāo)準(zhǔn)3級(表6)。

表4 ‘鹽稻1626’與對照稻瘟病抗性對比(南京)

表5 ‘鹽稻1626’與對照稻瘟病抗性對比(天津)

表6 ‘鹽稻1626’與對照品種稻米品質(zhì)對比

3 討 論

在傳統(tǒng)水稻抗病育種中，人工接種一般不能達(dá)到好的效果，利用分子標(biāo)記輔助選擇可以在水稻分離群體中定點(diǎn)、高效地獲得目標(biāo)單株，因此成為現(xiàn)代分子生物學(xué)與常規(guī)育種的結(jié)合點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水稻育種。同時，聚合育種因能顯著提高品種的抗病性，從而培育出抗性相對持久的優(yōu)良品種，越來越受到重視，[18]，已經(jīng)成為現(xiàn)代作物育種的一種重要方式。

倪大虎等[19]通過分子標(biāo)記輔助選擇與傳統(tǒng)的雜交、自交相結(jié)合的方法，成功將3個水稻抗病基因Xa21、Xa23和Pi-9聚合，選育出4個優(yōu)良的水稻品系。柳武革等[20]利用水稻抗源品種BL122，成功將稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2導(dǎo)入水稻兩系不育系GD-7S中，育成不育系吉豐A和安豐A，已應(yīng)用于雜交水稻配組。陳紅旗等[21]以含稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-33的水稻品種C101LAC和含稻瘟病抗性基因Pi-2的C101A51為供體、金23B為受體，采取多次回交與分子標(biāo)記選擇相結(jié)合的方法，開展了抗性基因聚合研究。王軍等[22]利用Pi-ta和Pi-b的基因標(biāo)記和Stv-bi緊密連鎖的分子標(biāo)記對分離世代進(jìn)行基因位點(diǎn)檢測, 聚合選育出抗性水稻新品系74121。

由于稻瘟病病菌隨著環(huán)境的變化容易發(fā)生變異，連續(xù)種植單一抗性品種會導(dǎo)致抗性逐漸減退，甚至可能喪失抗性。在抗性篩選過程中，也發(fā)現(xiàn)目前單一抗性基因存在時，稻瘟病的抗性水平不足，尤其是含有Pi-ta、Pi-b抗病基因的水稻品種或品系，抗性水平在逐漸下降。而本研究中含有2個以及2個以上抗性基因的水稻品系的稻瘟病抗性水平得到顯著提升，表明聚合多個廣譜性抗性基因的育種方法是行之有效的。因此，防治稻瘟病需要充分利用水稻遺傳多樣性，在不同年份和區(qū)域中種植不同類型的抗稻瘟病品種，同時加強(qiáng)對多個廣譜抗性的稻瘟病基因進(jìn)行聚合育種，延長抗性品種的使用年限。

除了通過基因聚合育種實現(xiàn)水稻品種的廣譜和持久抗性外，挖掘和利用廣譜持久性的抗性單基因也是目前需要關(guān)注的重點(diǎn)。最近，研究者[23]從谷梅四號中克隆到的Pigm被認(rèn)為具有廣譜持久的稻瘟病抗性基因，已成功被國內(nèi)多個科研院所和育種單位應(yīng)用于水稻抗性育種中[24-25]。另一個抗性基因Bsr-d1是來源于水稻地方品種“地谷”，Bsr-d1基因的啟動子區(qū)有1個關(guān)鍵堿基變異, 抑制了水稻體內(nèi)稻瘟病菌誘導(dǎo)的基因表達(dá), 從而造成水稻細(xì)胞內(nèi)的H2O2富集, 最終提高水稻的抗病性，并且對受體親本的產(chǎn)量和稻米品質(zhì)無明顯影響，表明該突變位點(diǎn)在今后的水稻育種中將會有廣闊的應(yīng)用前景[26]。

本研究中Pita、Pi-b和Pi-9都屬于NBS-LRR抗病家族，在生產(chǎn)中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但是聚合這3個基因的報道尚未見到，本文利用前期檢測到含有稻瘟病抗性基因Pi-9的鹽稻10號與含有抗性基因的Pi-ta、Pi-b的武運(yùn)粳8號配置雜交組合，成功選育出含有3個抗性基因的水稻品系YC3，通過自交選育，推薦參加中種集團(tuán)國家黃淮海聯(lián)合體試驗，成功培育出水稻抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的水稻新品種‘鹽稻1626’，2020年報請國家品種委員會審定。

4 結(jié) 論

過選育抗病品種是防治水稻稻瘟病最有效的方式，如果能夠?qū)鹘y(tǒng)育種方法與分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合起來，聚合多個廣譜抗病基因，定點(diǎn)、高效改良現(xiàn)有作物的抗病性，相信培育出更多具有廣譜、持久抗性的水稻品種將很快成為現(xiàn)實。