不同VIGS體系在棉花中沉默效率的研究

吳 潔，劉 帥，馬晶晶，楊兆光，喬艷艷，趙 沛，吳珍平，操宇琳，張朝軍

(1.江西省棉花研究所/國家棉花產(chǎn)業(yè)技術體系鄱陽湖綜合試驗站，江西 九江 332105;2.中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽 455000;3.塔里木大學，新疆 阿拉爾 843300)

【研究意義】病毒誘導的基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)技術是20世紀90年代興起的一種高通量、高效、快速的反向遺傳學技術。其原理是目標基因接入病毒載體，形成重組病毒后侵染植株，目標基因片段轉錄成dsRNA，隨后dsRNA被內(nèi)切酶Dicer類似物切割成21～24 nt的siRNA，siRNA在植株中與一些特定的蛋白質相結合形成RNA 誘導的沉默復合體(RNA induced silencing complex，RISC)，RISC與同源RNA互作，目標基因mRNA降解[1-3]。本文選用的2個VIGS體系棉花葉皺縮病毒(Cotton leaf crumple virus, CLCrV)載體和煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)載體是棉花中常用的2種VIGS體系。通常2種載體都可以通過沉默葉綠素合成基因，從而得到植株的白化表型[4-5]。【前人研究進展】TRV載體是自2001年以來運用最廣泛的VIGS載體，Gao等[6]在2011年將RNA病毒TRV介導的VIGS體系運用于研究棉花的基因功能。Tuttle等[5]在2008年通過用粒子轟擊和農(nóng)桿菌介導的方法建立了棉花中的DNA病毒CLCrV介導的VIGS體系。TRV體系在植株中的沉默持續(xù)時間短，而CLCrV體系表型可維持在棉花的整個生育期中[7-8],但對2個VIGS體系在棉花不同發(fā)育時期和不同部位沉默效率的研究較少。新霉素磷酸轉移酶基因(neomycinphosphotransferaseⅡ,nptⅡ)是轉基因植物中常用的選擇性標記基因，它通過合成新霉素磷酸轉移酶對卡那霉素(Kan)產(chǎn)生抗性。利用VIGS技術沉默轉基因植株中的nptII基因會使得轉基因植株喪失Kan抗性[9]。【本研究切入點】本研究以35S啟動子驅動的抗Kan的nptII基因為目標基因，構建2種VIGS體系介導的基因表達沉默載體，通過農(nóng)桿菌注射法侵染棉花子葉，對2個VIGS體系侵染的棉花植株不同時期及不同部位進行qRT-PCR檢測。【擬解決的關鍵問題】比較2套VIGS體系在棉花中的基因沉默效率和沉默時間的差異，為驗證棉花基因功能選取合適的VIGS體系提供參考，對棉花基因功能的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究使用的棉花材料為含有抗KannptⅡ基因的常規(guī)陸地棉(GossypiumhirsutumL.)品種中棉所41(CCRI 41)，由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所轉基因課題提供。

TRV空載體大腸桿菌pYL-156，TRV陽性對照農(nóng)桿菌，TRV輔助農(nóng)桿菌pYL-192，CLCrV陽性對照農(nóng)桿菌，CLCrV空載體大腸桿菌pCLCrVA，CLCrV輔助農(nóng)桿菌pCLCrVB等皆由轉基因實驗室保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞購自日本寶日醫(yī)生物技術有限公司。

多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(RNAprep Pure Plant kit)和質粒小提試劑盒(TIANprep Mini Plasmid Kit)購自北京天根生化科技有限公司，反轉錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、Taq酶及熒光定量試劑盒(SYBR?Premix ExTaq)購自日本寶日醫(yī)生物技術有限公司，無縫克隆酶(ClonExpress?Ultra One Step Cloning Kit)購自南京諾維贊生物科技有限公司，凝膠回收試劑盒購自北京普洛麥格生物技術有限公司，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、乙酰丁香酮(AS)、2% -巰基乙醇、卡那霉素、利福平等其他生化試劑購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1nptII基因的檢測 取播種1周后的CCRI 41棉花整株，CTAB法[10]提取基因組DNA作為模板，根據(jù)NCBI中公布的nptⅡ基因序列(GenBank: AUA17992.1)，使用Primer Premier 5軟件設計引物：nptII-F:CTATGACTGGGCACAACAGACAAT，nptII-R:TCGTCAAGAAGGCGATAGAAGG，擴增出的片段大小為 720 bp。

1.2.2 VIGS載體的構建 以CCRI 41基因組DNA為模板，使用Primer Premier 5軟件設計構建2個VIGS體系所需引物：TRV-F-XbaI:AAGGTTACCGAATTCTCTAGACCGGATCAAGCGTATGCAG，TRV-R-BamH I: CGTGAGCTCGGTACCGGATCCAAG ATGG ATTGCACGCAGG，擴增片段大小為 350 bp左右；CLCRV-F-SpeI:CAAAATGGCATGCCTGCAGACTAGTCCGGATCAAGCGTATGCAG，CLCRV-R-AscI:AGACCCCGTTATTGTTACCGGGCGCGCCAA GATGGATTGCACGCAGG，擴增片段大小為 350 bp左右。使用南京諾維贊生物科技有限公司的無縫克隆酶將擴增到的目的片段與其相應的VIGS載體連接，經(jīng)測序驗證獲得病毒重組干涉載體pYL-156-nptⅡ和pCLCrVA-nptⅡ。

1.2.3 農(nóng)桿菌的制備和侵染 將得到的重組質粒pYL-156-nptⅡ和pCLCrVA-nptⅡ分別轉化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中(具體步驟參照說明書)。挑取陽性克隆菌落PCR檢測正確后，將TRV體系中的陽性克隆菌落pYL-156-nptⅡ與pYL-156空載體農(nóng)桿菌，pYL-192輔助載體農(nóng)桿菌，TRV陽性對照農(nóng)桿菌菌液和CLCrV體系中的pCLCrVA-nptⅡ陽性克隆菌落，CLCrV空載體pCLCrVA農(nóng)桿菌，CLCrV輔助pCLCrVB農(nóng)桿菌，CLCrV陽性對照農(nóng)桿菌菌液，分別加入到含Kan、利福平(Rif)和硫酸慶大霉素(Gen)的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min，搖菌8～10 h。吸取 500 μl上述搖好的各菌液加入到Kan、Rif、Gen的LB三抗液體培養(yǎng)基中，并同時加入終濃度為10 mmol/L的MES和終濃度為20 μmol/L的AS，28 ℃，200 r/min搖菌過夜。取培養(yǎng)好的菌液于50 mL離心管中4000 r/min，4 ℃離心10 min收集菌體，加入適量重懸液(無菌蒸餾水中MES 10 mmol/L，AS 200 mmol/L，MgCl210 mmol/L)充分懸浮菌體，使用 Nanodrop2000C在 600 nm 波長下調整各菌液OD600=1.5左右。分別將已懸好的pYL-192輔助載體農(nóng)桿菌和CLCrV輔助pCLCrVB農(nóng)桿菌懸液與其相應VIGS體系目的基因、空載體、陽性對照農(nóng)桿菌懸液分別按照體積1∶1混勻，25 ℃靜置 3～6 h備用。

播種陸地棉CCRI 41種子，28 ℃，光照/黑暗=14/10h條件下培養(yǎng) 7 d后，取子葉平展、真葉還未冒出或剛冒出時的棉花幼苗，用注射器針頭輕劃一下子葉背面，用去掉針頭的1 mL注射器將菌液從背面注入棉花子葉，使菌液侵染整個子葉，注射面積達到98 %以上。注射后的棉花植株避光處理12 h，再次置于正常光照(28 ℃，光照/黑暗=14/10 h)下繼續(xù)培養(yǎng)[9]。

1.2.4 表型分析與PCR檢測 觀察2種體系TRV和CLCrV陽性對照棉花植株葉片白化時間和表型。當陽性對照葉片出現(xiàn)白化表型，取空白對照和nptⅡ沉默植株的葉片，用CTAB法提取DNA。設計TRV載體檢測引物TRV-A-F1：GTGGACTTAGATTCTGTGAGTAAGG；TRV-A-R1：ACGGATCTACTTAAAGAA CCGTAGT，PCR擴增片段大小為 256 bp。設計CLCrV載體檢測引物CLCrV-A-F1：GGGAGCTCCACTTGGGATAGGTTAAGAA；CLCrV-A-R1：CCATCGATGTCCCTTATTAACTTTAGGGC，PCR擴增片段大小為275 bp。檢測2種病毒載體是否成功侵染棉花植株。

1.2.5 qRT-PCR分析 取注射過nptII基因和空載體15、30、45、60、75、90 d的棉花葉片，以及75和95 d的蕾、花、花藥組織部位提取RNA。所用試劑盒為多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，具體方法參照說明)。將提取出的RNA用熒光定量反轉錄試劑盒(日本寶日醫(yī)生物技術有限公司)進行反轉錄(具體方法參照說明)，獲得2種體系的反轉錄產(chǎn)物cDNA。以棉花中的actin基因為內(nèi)參基因，內(nèi)參引物AF：5'-TTTGGCATCATACCTTT-3'，AR：5'-CACTGGCATATAGGGA-3'。設計檢測nptⅡ基因表達的特異引物nptⅡ-Q-F: 5'-CACGAGGAAGCGGTCA-3' 和nptⅡ-Q-R：5'-CCTGCTTGCCGAATATC-3'，對不同組織樣品中nptⅡ基因表達量進行qRT-PCR檢測，所用試劑為TaKaRa SYBR?Premix ExTaq(日本寶日醫(yī)生物技術有限公司，具體步驟參照說明)，所用儀器為Applied Biosystems 7500(Applied Biosystems，美國)。試驗設置3個生物學重復和3個技術性重復，獲得數(shù)據(jù)采用2-△△ct法計算相對表達量，使用EXCEL軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 中棉所41中nptⅡ基因的檢測

對陸地棉CCRI 41棉花植株進行PCR檢測，檢測其基因組中是否含有nptⅡ基因，結果顯示該品種植株能夠擴增出nptⅡ基因片段(圖1)，擴增片段大小為720 bp左右，與預期片段大小一致，擴增條帶單一，無非特異條帶，說明所選CCRI 41棉花植株基因組中含有nptⅡ基因片段。

2.2 2種病毒載體的構建

pYL-156-nptⅡ和pCLCrVA-nptⅡ 2個載體分別進行雙酶切驗證后，對構建好的TRV和CLCrV病毒沉默載體農(nóng)桿菌進行PCR擴增，分別得到350 bp左右的片段(圖2)，與預期片段大小一致，擴增條帶單一，無非特異條帶，表明目的載體pYL-156-nptⅡ和pCLCrVA-nptⅡ構建成功。

2.3 農(nóng)桿菌侵染后棉花葉片表型及PCR檢測

農(nóng)桿菌侵染12 d后，接種TRV陽性對照的植株葉片從頂端開始出現(xiàn)白化表型，空白對照植株頂端葉片顏色正常為嫩綠色(圖3-A)。侵染23 d后，接種CLCrV陽性對照的植株出現(xiàn)表型變化，頂端分生組織附近的幼嫩葉片開始出現(xiàn)白化表型，而空白對照葉片顏色正常未出現(xiàn)白化表型(圖3-B)。取2個體系沉默nptⅡ基因和空白對照棉花植株葉片，提取DNA，PCR擴增檢測TRV病毒載體和CLCrV病毒載體是否進入植株并起作用，擴增分別得到256和275 bp大小的片段(圖4)，與預期片段一致，表明2個病毒載體已作用于棉花植株中。

2.4 2個病毒體系葉片中nptⅡ基因沉默效率比較

檢測TRV體系和CLCrV體系15、30、45、60、75、90 d棉花葉片中nptⅡ基因的沉默效率，比較2個體系在棉花不同發(fā)育時期對目的基因沉默效率的持續(xù)性差異。與空載體對照相比，農(nóng)桿菌接種15 d，TRV體系植株葉片表達量被高度抑制(圖5)，沉默效率達到 99.6 %，而CLCrV體系在農(nóng)桿菌接種后30 d，目的基因抑制效果達到最強，沉默效率達到 85 %，說明TRV體系比CLCrV體系對目的基因的沉默效率高且TRV體系的沉默效果更快。后期TRV體系對目的基因的沉默效率逐漸減弱，在注射農(nóng)桿菌后75及90 d，沉默效率分別46 %和22 %，說明TRV體系對目的基因的沉默效率會隨著棉花植株的生長逐漸減弱。CLCrV體系在60、75、90 d的沉默效率分別為84 %、82 %、77 %，說明CLCrV載體能夠在棉花中持久、高效的誘導內(nèi)源基因的沉默。

2.5 2個病毒體系棉花生殖器官中nptⅡ基因沉默效率比較

檢測2個體系75和90 d在蕾、花、花藥中nptⅡ基因的沉默效率，比較2個體系在棉花不同發(fā)育部位對目的基因沉默效率的差異。TRV體系中只有蕾中的nptⅡ基因表達量被較少的抑制(圖6)，75、90 d的沉默效率分別為12 %和11 %，而棉花其它生殖器官發(fā)育部位基本不能誘導目的基因的沉默。CLCrV體系75和90 d在蕾中對nptⅡ基因的沉默效率分別為63 %和61 %，花中的沉默效率分別為46 %和51 %，花藥中的沉默效率分別為38 %和33 %，說明與TRV載體相比，CLCrV載體能夠在棉花蕾、花、花藥等生殖器官發(fā)育部位誘導目的基因的沉默。

3 討 論

VIGS 技術具有操作迅速、簡單、成本低，使用較小的片段達到較高的沉默效果以及短期內(nèi)能夠觀察到基因沉默后表型變化等的特點，特別適用于像棉花這樣的生長周期長、遺傳轉化過程費力耗時，基因組功能冗余的植物，因此被廣泛地應用于棉花基因功能的研究[11-13]。王心宇等[14]通過在棉花中建立TRV病毒誘導的基因沉默體系，抑制了棉花中GhMAPKKK基因的表達，使得抑制后的棉花植株接種黃萎病菌后更易感病，驗證了GhMAPKKK基因參與棉花對黃萎病菌的抗性反應的基因功能。VIGS病毒載體的選擇作為試驗的重要步驟，決定著試驗成功的關鍵。在驗證棉花中相關基因功能的研究中，前人選擇TRV病毒作為VIGS技術載體，驗證TRV-VIGS體系在不同棉種中的侵染效果和侵染部位；使用CLCrV作為VIGS技術載體，研究該病毒載體在棉花VIGS技術中建立和適用性[15-17]。本研究基于2種病毒載體構建了TRV-VIGS和CLCrV-VIGS2種體系，在同一棉花品種中驗證2種體系目的基因在棉花葉片中的沉默效率、沉默時間的差異以及棉花生殖器官中的沉默效率差異。

本研究構建了基于TRV病毒載體和CLCrV病毒載體的2種VIGS病毒沉默體系，成功侵染棉花后，TRV體系與CLCrV體系在不同發(fā)育時期葉片中相對表達量的比較，證明TRV病毒在棉花VIGS技術里是沉默效率較高的病毒載體，但持續(xù)時間較CLCrV體系短，且生長發(fā)育后期沉默效率逐漸降低。CLCrV體系基因沉默效率雖比TRV體系略低，但沉默效率較穩(wěn)定、持久，能夠作用于棉花植株生長發(fā)育的整個階段。比較TRV體系與CLCrV體系在不同生殖器官中的相對表達量，TRV體系在棉花生殖器官中的沉默效果不明顯，而CLCrV體系有較好的沉默效果，可作用于棉花蕾、花、花藥等部位，表明在研究棉花蕾、花、花藥等生殖器官中的基因功能時，可選用CLCrV介導的基因沉默表達載體。

4 結 論

TRV病毒沉默體系主要適用于接菌后短期內(nèi)棉花內(nèi)源基因的沉默，適用于抗逆基因的功能驗證；CLCrV病毒沉默體系適用于棉花生長發(fā)育過程中起長期作用基因的沉默，可以研究生殖生長相關的基因的功能。現(xiàn)階段已通過VIGS技術在棉花中成功鑒定出許多基因功能，為棉花的分子育種提供有價值的基因資源，本研究為驗證棉花中不同時期不同部位基因功能選擇不同VIGS載體提供理論參考，對研究棉花基因功能乃至基因工程具有重要意義。