鹽脅迫下水稻根系細菌群落多樣性研究

李曉東,高 攀,焦 飛,胡建勇*,時春明,張人銘

(1.新疆維吾爾自治區水產科學研究所，新疆 烏魯木齊 830000；2.農業部西北地區漁業資源環境科學觀測實驗站，新疆 烏魯木齊 830000)

【研究意義】新疆地處我國干旱半干旱地區，水資源時空分布不均，氣候條件特殊，鹽堿水域資源十分豐富。目前，這些鹽堿水資源受制于技術而未得到有效開發利用，造成資源浪費。從國內外的實踐和經驗看，鹽堿水域漁業是解決鹽堿水域資源開發的主要手段，而漁業養殖尾水的資源化利用是現代漁業的主要研究方向[1]。在傳統“魚-菜”、“魚-稻”綜合種養基礎上開發出適合鹽堿水漁業的“魚-植物”綜合種養模式對鹽堿水漁業的發展、漁業養殖尾水的處理具有重要意義。【前人研究進展】相比傳統的淡水池塘養殖，鹽堿水體復雜的離子結構與漁業生產產生的各類無機、有機代謝廢物的共同作用對于共生植物生理生化的影響更重要，并且這些影響大部分是不利且機理不明的，而植物根系微生物群落結構與植物生長發育有密切關系，尤其是根系有益菌群能夠促進植物對氮、磷等營養元素的吸收，增強對生物及非生物脅迫的抵御能力[2]。植物根系微生物群落包括存在于根內的內共生菌和根表的微生物菌群，其微生物種類包括細菌、放線菌、真菌、藻類和原生動物，就豐度而言，細菌含量最高，原生動物最低[3-4]。采用傳統的微生物分離鑒定方法研究植物根系微生物群落結構多樣性存在許多弊端。近年來，微生物宏基因組技術和高通量測序技術的發展為研究微生物群落結構多樣性提供了有效手段。因此，利用高通量測序技術研究植物根系微生物群落結構尤其是逆境下植物根系微生物群落結構對植物生長發育的影響對于揭示植物的抗逆機理具有重要意義[5-6]。在鹽脅迫條件下，植物根系微生物通過參與滲透調節、營養吸收等具體生理功能為共生植物提供保護，其本身群落結構的動態變化也受鹽脅迫的影響[7]。【本研究切入點】相比傳統的土壤-植物-微生物生態系統，“魚-植物”共生模式下的水-植物-微生物生態系統的相關研究較為薄弱，尤其在鹽堿漁業方面。【擬解決的關鍵問題】鑒于此，本研究通過利用高通量測序技術對鹽脅迫下的水稻根系細菌群落結構進行研究，為鹽堿水漁業發展“魚-植物”共生模式奠定相關基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以水稻品種秋田小町為研究對象，經育苗，大田生長，2019年7月10日移栽至新疆水生野生動物救護中心待用；選擇高度一致的水稻幼苗定植于花盆，每個實驗組定植9株。實驗組使用國產“蜀盆”牌無土栽培營養液水培15 d后按照鹽濃度0(樣品名稱OS-S0)、1 ‰(樣品名稱OS-S1)、2 ‰(樣品名稱OS-S2)、3 ‰(樣品名稱OS-S3)、4 ‰(樣品名稱OS-S4)、5 ‰(樣品名稱OS-S5)加入NaCl脅迫15 d。剪取一定長度的水稻根系經PBS(pH7.4)緩沖液漂洗后，置于20 mLPBS(pH7.4)緩沖液中，搖床震蕩30 min后經4 ℃ 12 000 r/min離心5 min富集根系土壤備用。

1.2 方法

1.2.1 根系土壤DNA提取 使用OMEGA公司E.Z.N.ATMMag-Bi-nd Soil DNA 試劑盒提取根系微生物DNA后凝膠檢測備用。

1.2.2 PCR擴增及高通量測序 根系微生物DNA使用 Life公司Qubit2.0 DNA試劑盒精確定量后使用上海生工的細菌16S rDNA通用引物進行第一輪擴增。引物序列。341F：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG (barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG；805R：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA(barcode) GACTACHVGGGTATCTAATCC。

上述PCR產物經引入Illumina橋式PCR兼容引物進行第二輪擴增后使用0.6倍磁珠(AgencourtAMPure XP)富集后經Life公司Qubit2.0 DNA試劑盒精確定量后委托上海生工使用Illumina MiseqTM平臺測序。

2 結果與分析

2.1 根系細菌群落多樣性測序數據處理

測序結果使用Cutadapt去除接頭引物序列后使用PEAR拼接測序結果；Prinseq對拼接序列進行過濾后得到高質量的測序結果；Usearch去除預處理后序列中非擴增區域序列，隨后對序列進行測序錯誤校正，并調用Uchime鑒定嵌合體。隨后，去除嵌合體的序列與數據庫代表性序列進行Blastn比對，低于閾值(97 %)的比對結果認為是靶區域外序列，并剔除掉該部分序列，最終得到可用于劃分操作分類單元( Opera-tional taxonomic units，OTU)的序列數(表1)。

表1 測序數據處理結果

2.2 根系細菌群落多樣性

Usearch對前述有效序列按照序列間的距離進行聚類，以序列之間的相似性不低于97 %的序列定義為一個OUT，最終得到的樣品OTU用韋恩圖表示(圖1)，不同鹽濃度脅迫處理下水稻根系微生物OTU絕大部分為共有類型，特有類型數量在不同樣品間差異較大；為更好表示出本研究不同處理間樣品OTU的相似性和差異關系，基于Beta多樣性距離矩陣進行層次聚類分析后使用非加權組平均法UPGMA算法構建樹狀結構(圖2)，不同鹽濃度脅迫下相似濃度均聚于一個分支，說明OUT相似性較高。

樣品的多樣性研究可通過多樣性分析(Alpha多樣性)反映微生物群落的豐度和多樣性，本研究使用Mothur計算不同處理樣品間多樣性指數(表2)。為更好地表示不同處理間樣品的菌群豐富度、測序數據量是否合理及不同樣品所含物種的豐富程度和均勻程度，分別構建了稀釋曲線(圖3)和Rank-abundance曲線(圖4)，發現隨著擴增數的增加稀釋曲線逐漸平緩說明測序數據合理，而Rank-abundance曲線較為粗糙，說明不同處理水稻根系微生物群落組成均勻程度低，不同類群差異較大。

表2 不同處理間樣品多樣性指數

對OUT進行物種分類信息分析是群落多樣性研究的常用手段，本研究采用RDP classifier分類方法，在科 (family，圖5)、屬 (genus，圖6)水平上對各處理組細菌菌群含量均高于0.1 %的優勢菌群進行了分類分析。

2.3 根系細菌不同群落相關性分析

通過分析科屬水平上各處理組細菌菌群含量均高于0.1 %的菌群與鹽度的相關性。發現在科水平上，Rhodobacteraceae科、Phyllobacteriaceae科與鹽度有顯著的正相關性，而Planctomycetaceae科、Pseudomonadaceae科、Verrucomicrobiaceae科、Caldilineaceae科、Anaerolineaceae科、Rhodospirillales科與鹽度有顯著的負相關性，Comamonadaceae科、Chitinophagaceae科、Acidobacteria_Gp4科與鹽度的相關性不顯著；在屬水平上，Gemmobacter屬與Aquisphaera屬與鹽度有顯著的正相關性，而Pirellula屬、Rhizobacter屬、Luteolibacter屬、Rubinisp-haera屬、Caldimonas屬、Reyranella屬與鹽度有顯著的負相關性，Litorilinea屬與鹽度的相關性不顯著。

3 討 論

根系細菌群落結構多樣性與生長發育階段、生長環境密切相關[7-9]，在不同鹽濃度處理下，水稻根系細菌群落OUT數隨著鹽濃度的增加呈現出先高后低的態勢，在鹽濃度為3 ‰時所獲得的OUT數最高，而韋恩圖也呈現出相同的結果；同樣，代表樣品菌群多樣性的Shannon指數、Simpson指數及代表樣品菌群豐度的Chao1指數、ACE指數均在鹽濃度為3 ‰時根系細菌群落豐度及多樣性最高。根據Rank-abundance曲線可知，不同處理間根系細菌群落均具有較大的豐度(橫軸長度)且曲線不夠平滑，說明細菌群落的均勻程度較低。在鹽堿條件下，植物根系微生物群落結構多樣性與植物的種類、品系、生長發育階段有密切關系[10-12]，Yaish[12]研究發現，海棗在300 mmol/L NaCl溶液處理下，根系細菌處理組OUT數、Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數均比對照組低，表明鹽處理能夠降低植物根系細菌群落豐度及多樣性；但也有研究者認為，低濃度鹽處理能夠增加土壤細菌群落數量[13]。基于本研究的結果，筆者認為鹽處理對植物根系細菌群落多樣性的影響與鹽濃度密切相關，高濃度處理(OS-S5)能夠顯著降低植物根系細菌群落的結構和數量，該結論已在多種植物的相關研究中獲得證實[14]；而在3 ‰鹽濃度處理時根系細菌群落豐度及多樣性最高。在鹽耐受范圍內，耐鹽植物能夠通過一些當前不明的機理促進有益菌群生長，以維護其正常生理功能[15]，對于非鹽堿植物，筆者認為出現該結果的原因在于對任何植物而言，如果鹽濃度在其可耐受范圍內(OS-S1、OS-S2、OS-S3)，或許存在類似于鹽堿植物的生理生化活動，Yang[16]研究菊芋時獲得了與本研究相似的結果。

高通量測序結果經生物信息學分析獲得不同處理間分類學上的細菌群落結構組成及結構的差異是本研究的核心所在，對各處理組細菌菌群含量均高于0.1 %的優勢菌群在科、屬水平上進行分類分析，在科水平上獲得11科；屬水平上獲得9屬。獲得的菌群科屬經相關性分析共有8科、8屬與鹽濃度具有顯著相關性(P<0.05)，其中Rhodobacteraceae科、Phyllobacteriaceae科、Gemmobacter屬、Aquisphaera屬與鹽濃度具有顯著正相關性(P<0.05)。Rhodobacteraceae科菌種絕大多數分離自海洋、鹽堿湖泊及鹽堿土中，少量分離自淡水環境中，其在海洋細菌群落中占30 %以上，并且常和真核生物共生[17]，現有研究表明Rhodobacteraceae科菌種可以通過促進共生藻類維生素合成以保證其在鹽堿環境下生存[18]，與鹽濃度顯著相關的Gemmobacter屬屬于該科[19]。Phyllobacteriaceae科菌種廣泛分布于各類環境中，在黃豆和苜蓿中該科菌種能夠促進植物生長[20]；在鹽脅迫條件下，Phyllobacteriaceae科菌種可通過ACC脫氨酶基因的表達促進植物生長[21]。相比前述科屬，Aquisphaera屬為本研究獲得的最具特殊的，就當前而言，該屬僅有一種為Aquisphaeragiovannonii(https://lpsn.dsmz.de/)，其是否有利于提高植物的抗鹽堿能力目前未見報道，需要進一步研究。

4 結 論

植物根系微生物群落結構采用水培方式研究植物根系微生物群落結構，可為后續的鹽堿水漁業“魚-植物”綜合種養模式提供技術支持，因為當前我國“魚-植物”綜合種養模式廣泛采用生物浮床進行生產，這樣的生產系統對植物而言其實就是改進版的水培系統，總而言之，在不同鹽濃度脅迫下，水稻根系細菌群落豐度及多樣性隨著鹽濃度的增加呈現出先高后低的態勢，3 ‰鹽濃度脅迫下最高，5 ‰鹽濃度脅迫下最低；Rhodobacteraceae科、Phyllobacteriaceae科、Gemmobacter屬、Aquisphaera屬與鹽濃度具有顯著正相關性(P<0.05)。因此，這些科屬所屬菌種在今后鹽堿水漁業發展“魚-植物”綜合種養具有潛在利用價值。