3種金花茶花芽分化進程及形態學特征比較

喇燕菲，肖麗梅，黃 涵，張進忠，孫明艷，王 翊*

(1.廣西農業科學院花卉研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西大學林學院，廣西 南寧 530004)

【研究意義】培育長花期金花茶組植物品種群一直以來均為金花茶組植物優良品種選育的重要目標和方向。目前金花茶組植物共有18個種，其中，金花茶[Camelliapetelotii(Merrill) Sealy]是世界上著名的觀賞品種之一，僅在冬季開花(花期在當年12月至次年1月)；四季金花茶(C.perpetuaS. Y. Liang et L. D. Huang)具有一年多次開花的優良特性，已成為培育四季開花山茶新品種的優良親本，為長花期金花茶育種提供了更多可能性[1]；淡黃金花茶(C.flavidaChang)是較少見的夏季開花山茶品種。金花茶雖在冬季開花，但在夏季已完成花芽分化[2]；四季金花茶一年四季均可完成花芽分化，但在冬季花芽分化數量相對較少；淡黃金花茶在夏季完成花芽分化后即開始花器官發育，短期內即可開花。可見，金花茶、四季金花茶和淡黃金花茶具有不同的開花特性，但原因至今尚不清楚。因此，分析該3種金花茶組植物的花芽分化特征，對金花茶組植物品種的長花期育種具有重要意義。【前人研究進展】花芽分化是一個復雜的形態建成過程，同時也是花器官形成的關鍵階段[3]。目前關于山茶屬花芽分化的研究多集中于茶樹[C.sinensis(L.) O. Ktze.][4]、油茶(C.oleiferaAbel.)[5-8]和少數山茶園藝品種[9-10。符喆[9]研究發現，耐冬山茶除存在單花芽和葉芽外，還具有能同時分化多個花芽和葉芽的混合芽。張軍莉等[11]研究認為，植物花芽分化可分為分化初期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期5個時期。王湘南等[12]研究表明，油茶雌雄蕊原基同時突起，即雌雄蕊同步出現，子房與花藥隨后形成，因此將油茶花芽分化過程分為花芽前分化期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房與花藥形成期和雌雄蕊成熟期6個時期。張鵬等[13]研究顯示，光照有利于高州油茶花芽提早分化，且花的外部形態可直觀反映內部結構的變化情況。溫玥[14]、蔡婭等[15]研究表明，外源激素赤霉素和多效唑均可提高不同油茶品種的花芽分化率和油茶產量。羅帥[16]研究發現，增施適量氮、磷和鉀肥也有利于油茶進行花芽分化。有關山茶屬植物花芽分化的研究已涉及形態學特征、激素影響和環境因子影響等方面，但關于金花茶組植物花芽分化的研究較少。唐健民等[17]研究顯示，東興金花茶的花芽分化始于12月下旬，整個分化時期持續1個多月，花芽分化的順序是由外至內，分為花芽未分化期、花芽分化始期、花萼分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期6個時期，各時期依次發生，且花芽分化期具有重疊現象。【本研究切入點】目前，針對單次開花金花茶、多次開花四季金花茶和夏季開花淡黃金花茶花芽分化特性的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】對金花茶、四季金花茶和淡黃金花茶的花芽分化過程進行動態拍攝，解剖觀察其不同分化階段花芽的形態學特征，并利用改良石蠟切片技術觀察花芽分化不同時期的結構，確定該3種金花茶組植物花芽分化所需時間，明確其花芽分化過程的差異，為金花茶組植物品種的長花期育種提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年5-12月在廣西大學熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室和廣西大學林學院植物制片室進行。選取南寧市金花茶基因庫中生長良好、無病蟲害發生的四季金花茶、淡黃金花茶和金花茶成年植株各5株，采集其一年生枝條或當年生新梢上的花芽為試驗材料。金花茶和淡黃金花茶花芽采樣時間均為2018年5-8月，四季金花茶花芽采樣時間為2018年3、6和9月，3種金花茶均各采樣3次，每次連續采樣1個月；每隔3～4 d收集花芽1次，每次每種金花茶采集花芽5～6枚保存于FAA固定液中。

1.2 花芽分化物候期及解剖觀察

于2018年5-9月，在上述選定3種金花茶植株的各方位分別選取5根生長健壯的一年生枝條，每隔3～4 d用照相機對生長的花芽進行拍攝，記錄物候期。花芽解剖在蔡司體視顯微鏡(德國SteREO Discovery.V12)下進行，花芽外部大小用ZEN(Blue edition V1.0)測量。其中，橫徑為花芽最寬處的寬度，縱徑為花芽頂部至基部的距離。每種金花茶每個發育階段解剖觀察花芽數不少于15個。

1.3 花芽石蠟切片

參照肖麗梅[18]的方法進行花芽石蠟切片，主要步驟如下：材料經固定、軟化，酒精梯度脫水，TO透明劑(主要成分為優質松節油[19])透明，石蠟浸蠟，再進行包埋；采用Leica DM 2016切片機制作8.0 μm厚切片，然后粘片、復水、0.05 %甲苯胺藍(Solarbio，G3668)染色，中性樹膠封片。在蔡司顯微鏡(德國Axio Imager 2)下選擇結構完整高清的切片進行拍攝。

1.4 統計分析

試驗數據采用Excel 2019進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 3種金花茶的開花特性

物候觀測發現，金花茶于10月底萌發抽梢，翌年大部分花芽著生于新梢長成的一年生枝條上，花芽分化時間為5-8月，期間花芽連續分化，同一植株不同枝條花芽分化不同步。9月后花芽分化基本完成，處于孕蕾階段，該階段花器官逐步發育直至翌年1月中上旬花朵開放；四季金花茶四季均可進行花芽分化，4-6月和9月兩次花芽分化比較集中，其中，4-6月分化的花芽數較多，9月分化的花芽數較少，而每年11月至翌年2月僅偶爾可見零星花芽分化；淡黃金花茶花芽分化較整齊，5月開始分化，花朵8月開放，偶爾有少量花芽分化滯后，可在秋冬季節見零星花朵開放。從圖1可看出，金花茶花芽從5月10日開始分化，至7月16日分化完成，持續66 d，此后進入花器官發育(孕蕾)階段，直至花朵開放；四季金花茶從6月1日開始分化，至6月29日分化完成，持續30 d，從現蕾至開放為90 d；淡黃金花茶從5月2日開始分化，至6月15日分化完成，持續43 d，從現蕾至開放107 d。

2.2 3種金花茶花芽的外部形態

金花茶、四季金花茶和淡黃金花茶花芽分化各時期的外部形態、大小和解剖觀察結果如圖2所示。根據花芽解剖統計數據，橫徑和縱徑可直觀反映花芽大小，但花芽橫徑大小可較準確地反映花芽分化所處時期。由表1可知，當金花茶花芽橫徑生長至2.3 mm時啟動花芽分化，生長至3.4 mm時進入雄蕊分化時期，雌雄蕊分化通常同步進行，當橫徑生長至5.0 mm時進入子房形成期，預示花芽分化即將完成；當四季金花茶和淡黃金花茶花芽橫徑生長至約1.5 mm時啟動花芽分化，生長至2.4 mm時進入雄蕊分化時期，生長至3.9和4.7 mm時進入子房分化期。

2.3 3種金花茶花芽分化的形態特征

根據3種金花茶花芽的形態特點(圖2～3)，可將其花芽分化時期劃分為未分化期、分化初期、苞片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期和子房形成期7個時期。

2.3.1 未分化期 在花芽未分化期，3種金花茶的營養生長錐體積較小(圖3-A1、圖3-B1和圖3-C1)，此時芽生長點的頂端分生組織(Sam)細胞較小、排列緊密，隨著營養生長錐進一步分化，其形態也有所變化，但從外觀和解剖結構進行觀察，都較難區分該階段的芽是葉芽還是花芽。

2.3.2 分化初期 進入花芽分化初期，花芽呈圓桃形，先端鈍，花芽形態較小，但已可從外觀上將花芽和葉芽區別開(圖2-A1、圖2-C1和圖2-E1)。石蠟切片結果顯示，該階段3種金花茶的花芽分化情形相似，均為生長錐明顯變寬，呈半圓形，基部膨大，形成染色較深的生殖生長錐，進而發育為花原基(圖3-A2、圖3-B2和圖3-C2)，且花原基兩側出現較肥厚的萼片原基。

2.3.3 萼片分化期 該階段花芽外觀形態多呈橢圓型，外有鱗片包被(圖2-A2、圖2-C2和圖2-E2)。其中，金花茶花芽大小為3.250 mm(橫徑)×3.925 mm(縱徑)，四季金花茶和淡黃金花茶的花芽略小(表1)。解剖觀察發現，該階段的生長錐下陷、變寬，逐漸趨于扁平，生長點周圍已分化出花萼原基，并逐漸將生長點覆蓋(圖2-B2、圖2-D2和圖2-F2)。石蠟切片結果顯示，生長錐由半圓緩慢變寬變平，中間為中央分生組織，兩側苞片原基迅速分化(圖3-A3、圖3-B3和圖3-C3)；在四季金花茶和淡黃金花茶花芽中央分生組織的兩側可觀察到兩個突起(圖3-A3和圖3-B3)，為花瓣原基，而此階段金花茶的花芽中未出現花瓣原基。

分化階段Differentiation stage縱橫徑Vertical and horizontal diameter形態大小(mm) Shape size金花茶C. petelotii四季金花茶C. perpetua淡黃金花茶C. flavida分化初期橫徑2.699±0.3141.738±0.2251.880±0.381縱徑3.230±0.4472.246±0.3982.391±0.282萼片形成期橫徑3.250±0.1612.043±0.1222.370±0.376縱徑3.925±0.4002.498±0.2912.712±0.401花瓣形成期橫徑3.516±0.3452.274±0.1562.640±0.203縱徑4.492±0.7922.733±0.4113.140±0.374雄蕊分化期橫徑3.920±0.5222.419±0.0462.911±0.235縱徑4.492±0.7923.193±0.1983.762±0.602雌蕊分化期橫徑4.636±0.2913.343±0.3323.421±0.563縱徑5.393±0.6753.673±0.4934.071±0.822子房形成期橫徑5.177±0.1004.437±0.5645.122±0.431縱徑5.406±0.4074.409±0.9575.870±0.514

2.3.4 花瓣分化期 該階段花芽繼續生長，呈橢圓形(圖2-A3、圖2-C3和圖2-E3)。其中，金花茶花芽大小為3.516 mm×4.492 mm，四季金花茶花芽大小為2.274 mm×2.733 mm，淡黃金花茶的花芽比四季金花茶的花芽稍大(表1)。解剖觀察發現，花芽中央的生殖錐明顯變寬變凹，生殖錐周圍已分化出花瓣原基(圖2-B3、圖2-D3和圖2-F3)。石蠟切片結果顯示，該階段生殖錐繼續加寬；隨著分化進程的進行，花瓣原基逐漸形成并向上伸展(圖3-A4、圖3-B4和圖3-C4)。其中，四季金花茶和淡黃金花茶花芽中央的分生組織區出現很多小突起(圖3-A4和圖3-B4中*所示處)，為雄蕊原基，該處細胞排列緊密、有規則，而此階段金花茶的花芽中未出現雄蕊原基。

2.3.5 雄蕊分化期 該階段花芽繼續膨大，形狀近圓球形(圖2-A4、圖2-C4和圖2-E4)。解剖觀察發現，花瓣原基形成后在其內側逐漸分化出雄蕊原基。其中，四季金花茶雄蕊原基和雌蕊原基的分化幾乎同步進行，而金花茶和淡黃金花茶分化形成多列雄蕊原基后才觀察到雌蕊原基分化(圖2-B4、圖2-D4和圖2-F4)。石蠟切片結果顯示，該階段的生殖錐繼續加寬，部分略微凹陷，其上出現雄蕊原基，隨著雄蕊原基的分化，最終形成排列有序的雄蕊群。雄蕊群細胞分裂旺盛，染色較深(圖3-A5、圖3-B5和圖3-C5)，其中，金花茶和淡黃金花茶花芽中央的分生組織仍不斷分化出雄蕊原基，而四季金花茶花芽中央的分生組織已經出現雌蕊原基(圖3-A5中★所示處)。

2.3.6 雌蕊分化期 該階段花芽繼續膨大，其中四季金花茶花芽明顯變大(圖2-A5)，從雄蕊形成期的2.419 mm×3.193 mm增至3.343 mm×3.673 mm(表1)。解剖觀察發現，該階段3種金花茶的雄蕊已經分化完成，雌蕊正在分化(圖2-B5、圖2-D5和圖2-F5)。石蠟切片結果顯示，生殖錐的中央緩慢向上凸起，形成心皮原基，心皮原基在分化過程中繼續生長逐漸長高、加寬，且各心皮聯合形成子房腔。從圖3-B6和圖3-C6還可看出，淡黃金花茶和金花茶的心皮原基在分化過程中其邊緣生長迅速而互相愈合，并繼續向內卷曲生長(圖3-C6)直達中心部分，從而形成一個具有3和5室子房的雌蕊[20]，而四季金花茶在心皮快速分化的同時，中央軸的分化同步進行，最后形成子房(圖3-A6)，分化速度快于金花茶和淡黃金花茶。

2.3.7 子房形成期 進入子房形成期預示著花器官分化即將完成。該階段3種金花茶的花芽均呈球形，被多層鱗片(圖2-A6、圖2-C6和圖2-E6)。解剖觀察發現，雄蕊群已分化完成，子房也相對完整(圖2-B6、圖2-D6和圖2-F6)。石蠟切片結果顯示，隨著雌蕊原基伸長，上部合攏形成柱頭，下部為花柱，花柱逐漸膨大，形成子房(圖3-A7、圖3-B7和圖3-C7)，其中四季金花茶在子房發育的同時形成中軸座，并在中軸座上分化出胚珠原基。

3 討 論

本研究中，同為兩性花植物的金花茶、四季金花茶和淡黃金花茶在花芽分化過程中雄蕊發育均略早于雌蕊，但后期基本同步，與韋霄等[2]對金花茶的研究結果相似，這也是金花茶組植物在雜交育種中無需套袋而進行異花授粉的原因。

本研究通過物候觀測結合花芽解剖觀察，發現冬季開花的金花茶花芽分化持續時間為66 d，夏季開花的淡黃金花茶花芽分化持續時間為43 d，而四季均可開花的四季金花茶花芽分化持續時間最短，僅30 d，3種金花茶的花芽分化持續時間存在較大差異，可能與其在不同季節開花的品種特性有關，與陳政等[21]研究認為梅樹早花品種花芽分化持續時間較短、晚花品種花芽分化持續時間較長的觀點相似；3種金花茶組植物花芽分化所需時間均與茶樹[4]、油茶[5]、東興金花茶[17]和杜鵑紅山茶(Camelliaazalea)[22]相近，但明顯較觀賞山茶(Camelliaspp.)[9-10]短；金花茶的花器官發育(孕蕾)約需8個月，四季金花茶和淡黃金花茶花器官發育(孕蕾)均約需2個月，三者的孕蕾時間總體上均較長，是否存在休眠現象需進一步探究。

已有研究表明，通過觀察花芽外部形態可確定花芽分化階段，如薄殼山核桃(Caryaillinoensis)和香港四照花(Dendrobenthamiahongkongensis)的外部形態與花芽內部分化所處階段聯系較緊密，這類植物可根據花芽的外部形態特征推測其花芽分化狀況[23-24]。但也有很多植物花芽的外部形態與內部分化階段聯系不緊密，如簕杜鵑(Bougainvilleaspectabilis)花芽分化前期外觀形態變化不明顯，不能直觀反映其內部的結構變化，而后期分化速度加快，芽體變化明顯，又能從芽體的外部形態判斷花芽分化進程[25]。本研究中，3種金花茶組植物花芽分化過程中花芽的外部形態并無典型區別，僅花芽的大小變化較明顯，其橫徑與花芽分化所處階段密切相關，即隨著花芽分化的進行，花芽的橫徑逐漸增大，因此可根據花芽橫徑大小判斷花芽所處分化階段，而根據縱徑大小判斷發育階段容易造成誤判(如金花茶花瓣形成期的花芽縱徑為4.492 mm，雌蕊形成期的縱徑也為4.492 mm)，與朱雯等[26]發現廣寧紅花油茶花芽的橫徑縱徑比變化特征與不同分化期存在一定的對應聯系，但整體上是先由大變小、再變大的研究結果存在差異，推測與廣寧紅花油茶花芽的縱徑變化不規律有關。

本研究將3種金花茶組植物花芽分化過程劃分為未分化期、分化初期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期和子房形成期7個時期，與何春燕[27]對普通油茶的劃分結果一致；3種金花茶組植物的花芽在花瓣形成期、雄蕊形成期和雌蕊形成期或多或少具有重疊分化現象，與張逸[4]對茶樹的觀察結果相似；解剖可觀察到3種金花茶組植物雌蕊和雄蕊分化及以后的分化階段重疊進行，石蠟切片結果則顯示四季金花茶花芽分化階段重疊現象較另外兩種金花茶明顯，萼片分化、花瓣分化、雄蕊分化和雌蕊分化階段均與其他分化階段同步進行，且在子房形成過程中可同步形成中軸座，并分化形成胚珠，這在另兩種金花茶中未有發現；3種金花茶組植物花芽分化速度不同，其中四季金花茶的花芽分化速度較快，是否與花芽中成花基因的相對表達量較高有關尚待進一步探討。

韋霄等[2]研究發現，金花茶花朵開放后花藥即已成熟，柱頭同時分泌粘液，但在開花后2 d內花藥便失去散粉能力。本研究對3種金花茶組植物花芽分化過程的形態學和開花日期觀測結果表明，四季金花茶、金花茶和淡黃金花茶花朵分別在花芽分化完成(花芽橫徑約5.00、5.27和5.55 mm)后約2個月、8個月和2個月開放。因此，在金花茶組植物雜交育種尤其是大量群體雜交育種的工作中，應提前做好雜交準備，以免耽誤最佳授粉日期。

4 結 論

金花茶、四季金花茶和淡黃金花茶的開花習性存在明顯差異，但花芽分化過程相似；四季金花茶的萼片分化與花瓣分化、花瓣分化與雄蕊分化等階段可同步進行，重疊分化現象較其他兩種金花茶更明顯，可作為金花茶類植物育種、園林應用及開花調控機制研究的參考依據。