紫蘇褐斑病菌的分離鑒定及抑菌劑的室內毒力測定

趙劉趙，商志偉，楊小華，羅 充*

(1.貴州師范大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550000；2.貴州省農業科學院 油菜研究所，貴州 貴陽 550006；3.貴州省銅仁市碧江區農業農村局，貴州 銅仁 554300)

【研究意義】褐斑病是造成作物大量減產的常見病害之一，其具有發病快，傳染力強等特點。一旦有植株感染可快速傳播，使大批植株感染，導致葉片枯死、脫落，嚴重減產。【前人研究進展】植物的褐斑病多由鏈格孢屬真菌(AlternariaNees)引起[1-5]，且往往使受感染的植物產生相應癥狀。獼猴桃褐斑病的典型癥狀為葉片上具有明顯輪紋的褐色壞死斑，病斑直徑為1～2.5 cm[6]；柑橘感染褐斑病后出現莖干底部腐爛、幼苗死亡、流膠等癥狀[1]。鏈格孢屬真菌的分生孢子營腐生或寄生，其代謝產物含毒素，可使農作物產生黑斑病或褐斑病等病癥，進而產生葉斑和組織腐爛等[6]。鏈格孢屬真菌不僅對植物產生危害，其還能產生70多種有毒代謝物，攝入被鏈格孢毒素感染的食品可使人、畜產生中毒現象，嚴重時還可能致畸和致癌等[7]。甲霜錳鋅、烯酰錳鋅和代森錳鋅對防治植物真菌有明顯效果，其中，代森錳鋅常被用于防治植物的褐斑病[6，8-9]。【本研究切入點】目前關于紫蘇的研究多集中在紫蘇成分的分離純化或基因層面[10-15]，鮮見關于紫蘇褐斑病的研究。【擬解決的關鍵問題】鑒于此，采用形態學與分子生物學相結合對從紫蘇褐斑病病葉分離到的菌株進行鑒定，在此基礎上采用抑菌圈法室內測定3種常見抑菌劑對紫蘇褐斑病的防治效果，以期為規模化生產紫蘇褐斑病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 病原 感染紫蘇(PerillafrutescensL.Britt.)葉片，采自貴州師范大學生命科學院實驗基地，葉片即采即用。

1.1.2 試劑 DP336試劑盒，成都擎科梓熙生物技術有限公司。

1.1.3 藥劑 72 %甲霜錳鋅(主要成分為8 %甲霜靈、64 %代森錳鋅)，允發化工(上海)有限公司；69 %烯酰錳鋅(主要成分為9 %烯酰嗎啉、60 %代森錳鋅)，江蘇輝豐農化股份有限公司；70 %代森錳鋅可濕性粉劑，陜西道森農業生態科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌株的分離純化與鑒定 ①材料預處理。選取新鮮染病的紫蘇葉片，將其置于流動自來水下沖洗30 min，然后浸泡于75 %酒精中在超凈工作臺上消毒6 s左右，取出用無菌水將其表面多余的酒精沖洗干凈后，使用2 %升汞溶液消毒2 min，再用無菌水沖洗葉片表面殘余藥品溶液，之后使用高壓滅菌處理的干燥濾紙擦干葉片備用。②分離純化。用消毒的解剖針在葉片有斑塊的地方輕刮幾下，將刮下的病菌孢子用劃線法接種至PDA培養基上，然后置于25 ℃恒溫培養箱中黑暗培養2～3 d。挑選分離培養基中數量和面積均占主導地位的菌落，用消毒解剖針刮下其孢子，在PDA培養基上進行接種。將接種的培養基置于25 ℃恒溫培養箱中黑暗培養2～3 d；反復接種培養直至培養基上只有單一菌落即完成純化工作。③鑒定。以純化的培養基制備孢子懸浮液，用DP336試劑盒提取菌種DNA，并以此DNA為模板，以通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進行PCR擴增。PCR檢測病原菌株反應條件：94 ℃預變性5 min，30個循環(98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s)，72 ℃終延伸，保存于4 ℃。擴增后的片段溶于無菌去離子水中，置于-20 ℃保存備用。用1 % Tsingke高純度低電滲瓊脂糖電泳，在150 V、100 mA的環境下電泳20 min；然后用DNA凝膠回收試劑盒對所需DNA目的條帶進行切割，直接對純化后的PCR產物進行引物測序。

1.2.2 抑菌劑的篩選 將70 %代森錳鋅、72 %甲霜錳鋅和69 %烯酰錳鋅按照使用說明稀釋成500、600、700和800倍液。將事先純化好的培養基中的真菌孢子制備成1×106個/mL孢子懸浮液，在PDA平板培養基上接種0.1 mL的孢子懸浮液，于25 ℃黑暗恒溫培養24 h。將直徑6 mm的無菌濾紙片在藥品稀釋液中浸沒10 min，取出放在均勻涂抹菌液且已培養24 h的培養基中，每個培養基中均勻放置4片濾紙(分別經同一藥品不同濃度的藥液浸泡)，對照組放置浸泡清水的濾紙片。共計13個處理，3次重復。于25 ℃黑暗恒溫培養5 d后，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑并記錄，計算抑菌率。根據濃度(x)和抑菌率(y)擬合3種藥劑的毒力回歸方程，并計算EC50。

抑菌率=(處理直徑-對照直徑)/處理直徑×100 %

1.3 數據統計與分析

采用Excel 2010和Spss 25對數據進行統計與處理。

2 結果與分析

2.1 病原菌鑒定

2.1.1 形態學 從圖1可見，病原菌菌落為圓形或近圓形，中間為深褐色，邊緣為灰白色，隨著菌落的擴大，褐色面積逐漸增大，最終變為黑色，有豐富氣生菌絲，表面為絨毛狀；分生孢子梗多為單生或簇生，形狀多為長卵圓形、棒形或梨形，有多個橫隔膜，分隔處有縊縮。結合菌落形態、分生孢子類型等參照《中國真菌志》[16]，初步判斷該菌株為鏈格孢屬真菌(Alternariasp.)。

2.1.2 分子生物學 從圖2～3看出，利用ITS4/ITS4真菌通用引物對試劑盒提取到的病原菌DNA進行PCR擴增，獲得擴增片段大小為700 bp左右。將樣本ITS測序結果在NCBI庫中與登記的物種進行同源性檢索比對發現，其與Altemariaaltemata(序列號MG755752.1)的同源率達100 %，再結合形態學鑒定結果，確定該菌株為鏈格孢屬真菌(Alternariaalternata)。

2.2 不同藥劑的抑菌效果

從圖4和表1看出，PDA培養基上紙片周圍出現明顯的抑菌圈，不同藥品及其不同濃度所產生的抑菌圈大小不同。

2.2.1 抑菌率 不同藥劑的抑菌率均與稀釋倍數成反比，即隨著稀釋倍數增加，各藥劑抑菌率呈下降趨勢。500～800倍，72 %甲霜錳鋅、69 %烯酰錳鋅和70 %代森錳鋅的抑菌率分別為61.9 %～73.4 %、66.3 %～69.7 %和64.3 %～67.7 %，以稀釋500倍時3種藥劑的抑菌率均最大。72 %甲霜錳鋅的抑菌率波動較大，最大值與最小值相差11.5 %，二者存在顯著差異；其次是69 %烯酰錳鋅，相差4.8 %；70 %代森錳鋅相差最小，相差3.4 %。在最大稀釋倍數(800倍)時，70 %代森錳鋅的抑菌效果最佳，為66.3 %；72 %甲霜錳鋅的抑菌效果相對較差，為61.9 %。70 %代森錳鋅和69 %烯酰錳鋅各濃度的抑菌率無顯著差異，72 %甲霜錳鋅800倍液的抑菌率與該藥劑其余濃度間差異顯著。經擬合濃度(x)與抑制率(y)得到3種藥劑的毒力回歸方程：y代森錳鋅=6.92+0.52x(R=0.952*)，y甲霜錳鋅=9.78+1.52x(R=0.970*)和y烯酰錳鋅=6.61+0.43x(R=0.956*)，其相關系數均接近1，說明，據此得出的EC50可信度較高。其中，69 %烯酰錳鋅EC50為0.16 μg/mL，菌絲整體抑制效果最好；70 %代森錳鋅的抑制效果其次，其EC50為0.19 μg/mL；72 %的甲霜錳鋅EC50為0.76 μg/mL，對菌絲的抑制未產生明顯效果。

2.2.2 抑菌圈直徑 不同藥劑隨著藥品稀釋倍數增加其平均抑菌圈直徑均逐漸減小。500～800倍，72 %甲霜錳鋅、69 %烯酰錳鋅和70 %代森錳鋅的抑菌圈直徑分別為15.76～22.53、16.81～18.56和17.79～19.79 mm，3種藥劑的抑菌圈直徑均在最低稀釋倍液(500倍)時達最大。70 %代森錳鋅和69 %烯酰錳鋅各濃度間抑菌圈直徑無顯著差異，72 %甲霜錳鋅800倍液的抑菌圈直徑與該藥劑其余濃度間差異顯著(圖4，表1)。

表1 不同藥劑各濃度處理病原菌的抑菌率與抑菌圈直徑

3 討 論

鏈格孢屬真菌是世界上分布最廣的真菌之一，可侵害多種植物，在作物間極易傳播，造成不同作物相互感染，致使作物大量減產。因此，挑選容易購買，經濟有效的抑菌劑十分重要。72 %甲霜錳鋅、70 %代森錳鋅和69 %烯酰錳鋅均屬于低毒高效的廣譜性抑菌劑。研究結果表明，除在最高和最低濃度時藥品抑菌率差異性顯著外，3種藥劑中間濃度的抑菌率差異不顯著，可能因3種藥品的有效成分均含有代森錳鋅所致。3種藥劑在高濃度時對鏈格孢屬真菌有較好的抑制效果，與馮連榮等[9]的結果一致，但考慮到對植株本身的傷害和污染問題，選用較低濃度即有明顯效果的抑菌劑最好。69 %烯酰錳鋅EC50最低，為0.16μg/mL，對菌絲生長的整體抑制效果最好，可作為紫蘇褐斑病防治的首選藥物之一。同時，72 %甲霜錳鋅的抑菌率大小差值較大，說明隨著濃度減小，其抑菌效果將大幅下降，因此使用時應選擇適宜存濃度。70 %代森錳鋅也具有較好的抑制效果，500倍稀釋液的抑菌率將近70 %，與劉娟等[1，9]的結果相似。

紫蘇整個生長期均有可能感染褐斑病，災害嚴重時可造成植株大片死亡，最終導致嚴重減產。除在紫蘇感染時使用抑菌劑進行補救外，提高田間管理質量也十分重要。當植株開始出現枯斑時，應在早晨去掉葉面的水；當周圍其他植物出現褐斑病病害時，應及時隔離或噴灑農藥，防止大規模傳染。

該研究對紫蘇褐斑病的病原菌只鑒定到屬，藥劑篩選只能反映出3種藥劑的室內效果。田間的實際施用效果及藥劑交替噴施效果等問題還有待更深入的研究。同時，有研究表明[17]，在其他真菌病害的防治方面，植物提取液也有一定效果。因此，研究植物提取液對紫蘇褐斑病的防治效果同樣具有重要意義。

4 結 論

該研究確定紫蘇褐斑病的病原菌株為鏈格孢屬真菌(AlternariaNees)；3種常規廣譜抑菌劑72 %甲霜錳鋅、70 %代森錳鋅和69 %烯酰錳鋅的500～800倍液均對紫蘇褐斑病有一定的防治效果，其中，69 %烯酰錳鋅對菌絲生長的整體抑制效果最好，其EC50為0.16 μg/mL。