超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定大黃中9種蒽醌類成分含量*

王啟斌，葉 方，黃良永，杜士明，盧 偉

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000； 2.武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點實驗室·湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000）

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim，ex Balf.或藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根和根莖[1]，性寒，味苦，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃功效[2]。研究顯示，大黃中含有蒽醌類衍生物、二苯乙烯苷、鞣質(zhì)、有機酸等100多種化合物[3]。體內(nèi)外試驗研究表明，大黃具有瀉下[4]、抗菌[5]、抗炎、調(diào)脂、保肝、利膽、利尿、抗凝血、抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防慢性腎衰竭、治療肥胖性疾病等多種藥理作用[6－7]。2020年版《中國藥典（一部）》將蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚的總含量作為評價藥材質(zhì)量的指標(biāo)。目前對大黃的研究主要集中在上述5種化合物，這些游離蒽醌結(jié)合型化合物在大黃中也有較高含量，且具有多種藥理活性[8－16]。本試驗中采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS/MS）法同時測定大黃中9種蒽醌類成分的含量，為大黃中蒽醌類化合物的研究提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity型超高效液相色譜儀，XEVOTQ型串聯(lián)質(zhì)譜儀，均購自沃特世科技（上海）有限公司；GWAUN1型純水儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；AUW120D型分析天平（島津＜上海＞實驗器材有限公司）；VORTEX－6型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；5427R型冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

大黃素對照品（批號為110756－201711，含量為99.5%），大黃酸對照品（批號為110757－201607，含量為99.3%），大黃酚對照品（批號為110796－201616，含量為99.6%），大黃素甲醚對照品（批號為110758－201616，含量為99.0%），蘆薈大黃素對照品（批號為110795－201710，含量為98.3%），均購自中國食品藥品檢定研究院；大黃素8－O－β－D－葡萄糖苷對照品（批號為18080601，含量≥98%），大黃素甲醚8－Oβ－D－葡萄糖苷對照品（批號為19102401，含量≥98%），大黃酚8－O－β－D－葡萄糖苷對照品（批號為17111303，含量≥98%），大黃酸8－O－β－D－葡萄糖苷對照品（批號為17101705，含量≥98%），均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。大黃藥材（批號分別為201809，201810，201811）購自湖北神農(nóng)本草藥業(yè)有限公司，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院葉方副教授鑒定為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Waters Acquity UPLC? BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相為2 mmol/L甲酸銨溶液（A）－乙腈（B），梯度洗脫（0～0.5 min時10%B，0.5～1.5 min時10%→30%B，1.5～6.0 min時30%→70%B，6.0～7.0min時70%→90%B，7.0～8.5min時90%B，8.5～9.0 min時90%→10%B，9.0～10.0 min時10%B）；流速為0.2 mL/min；柱溫為40℃；進樣量為5μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），脫溶劑溫度為400℃，脫溶劑流速為800 L/h，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下負(fù)離子掃描。化學(xué)成分質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1，質(zhì)譜圖見圖1。

表1 9種化學(xué)成分的質(zhì)譜檢測參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry parameters of nine chemical constituents

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：精密稱取9種化學(xué)成分對照品各適量，分別加入甲醇－二甲基亞砜溶液（50∶50，V/V），制成大黃素（81.5μg/mL）、大黃酸（110.5μg/mL）、大黃酚（114.0μg/mL）、大黃素甲醚（120.4μg/mL）、蘆薈大黃素（118.6μg/mL）、大黃素8－O－β－D－葡萄糖苷（106.4μg/mL）、大黃素甲醚8－O－β－D－葡萄糖苷（108.40μg/mL）、大黃酚8－O－β－D－葡萄糖苷（107.7μg/mL）、大黃酸8－O－β－D－葡萄糖苷（102.0μg/mL）的單一對照品溶液。各取適量，加入甲醇，制成大黃素（4.075μg/mL）、大黃酸（5.525μg/mL）、大黃酚（5.70μg/mL）、大黃素甲醚（6.02μg/mL）、蘆薈大黃素（5.93μg/mL）、大黃素8－O－β－D－葡萄糖苷（5.32μg/mL）、大黃素甲醚8－O－β－D－葡萄糖苷（5.42μg/mL）、大黃酚8－O－β－D－葡萄糖苷（5.385μg/mL）、大黃酸8－O－β－D－葡萄糖苷（5.10μg/mL）的混合對照品溶液。

供試品溶液：取藥材樣品粉末（過4號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液1 mL，用甲醇稀釋至100 mL，即得。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項下混合對照品溶液，加入甲醇倍比稀釋，得系列混合對照品溶液。精密量取5μL，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。以待測化學(xué)成分質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程線性范圍及定量限Tab.2 Linear ranges of regression equation and limit of quantitation

定量限（LOQ）考察：分別精密量取2.2項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1項下試驗條件進樣測定，以信噪比（S/N）為10∶1時分別計算LOQ。結(jié)果見表2。

精密度試驗：取2.2項下混合對照品適量，進行20倍稀釋，按2.1項下試驗條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃素8－O－β－D－葡萄糖苷、大黃素甲醚8－O－β－D葡萄糖苷、大黃酚8－O－β－D葡萄糖苷、大黃酸8－O－β－D葡萄糖苷峰面積的RSD分別為2.68%，2.91%，2.24%，2.04%，1.05%，4.05%，3.85%，1.95%，3.48%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃素8－O－β－D葡萄糖苷、大黃素甲醚8－O－β－D葡萄糖苷、大黃酚8－O－β－D葡萄糖苷、大黃酸8－O－β－D葡萄糖苷峰面積的RSD分別為2.86%，2.64%，1.36%，1.28%，1.39%，3.31%，2.90%，1.81%，2.06%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取藥材樣品（批號為201809）粉末適量，按2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，再按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃素8－O－β－D葡萄糖苷、大黃素甲醚8－O－β－D－葡萄糖苷、大黃酚8－O－β－D－葡萄糖苷、大黃酸8－O－β－D－葡萄糖苷峰面積的RSD分別為3.39%，3.03%，2.64%，4.65%，2.68%，2.81%，3.81%，4.25%，2.24%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的藥材樣品（批號為201809）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的單一對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取3批藥材樣品各適量，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下試驗條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果見表4。

表4 大黃藥材樣品中9種化學(xué)成分含量測定結(jié)果（%，n=3）Tab.4 Content determination of nine chemical constituents in Rhei Radix et Rhizoma（%，n=3）

3 討論

蒽醌類化合物是蓼科植物大黃、虎杖和何首烏等藥材的主要化學(xué)成分和藥理活性成分，2020年版《中國藥典（一部）》中將5種游離蒽醌總含量作為大黃的質(zhì)控指標(biāo)。目前，關(guān)于大黃化學(xué)成分的研究也主要集中于該5種游離型蒽醌，但結(jié)合型蒽醌和蒽酮類化合物在大黃中含量也較高。結(jié)合型蒽醌類化學(xué)成分的藥理活性研究較少，其化學(xué)成分含量測定方法研究較少是原因之一。大黃藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究尚未完全明確，多成分含量測定更有利于大黃質(zhì)量和藥效作用機制的研究。

大黃中游離蒽醌類化學(xué)成分具備很好的紫外吸收，在藥材質(zhì)量控制中可采用高效液相色譜法進行研究。預(yù)試驗中，游離蒽醌和結(jié)合型蒽醌在同一提取條件下含量差異很大，且游離蒽醌和結(jié)合型蒽醌結(jié)構(gòu)相似，采用高效液相色譜法各成分間的相互干擾明顯，需要較長的分離時間[2]，較難得到理想的色譜圖。前期研究顯示，蒽醌類化合物進入人體內(nèi)的含量很低，且蒽醌類化合物間在人體內(nèi)存在相互轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象[17]，很大程度上影響了該類化合物在人體內(nèi)處置過程的研究，需要更高效的分析方法。

本研究中對不同流動相體系（水－乙腈、0.1%甲酸水溶液－乙腈、0.1%甲酸水溶液－甲醇、2 mmol/L醋酸銨溶液－乙腈、2 mmol/L甲酸銨溶液－乙腈）進行了考察優(yōu)化，通過觀察峰面積，最終選擇2 mmol/L甲酸銨溶液－乙腈作為流動相。本研究中所建立的UPLCMS/MS法在10 min內(nèi)能同時測定大黃中5種游離型蒽醌化學(xué)成分和4種結(jié)合型蒽醌類化學(xué)成分，且靈敏、準(zhǔn)確，可為于大黃蒽醌類化學(xué)成分研究提供參考。