頂空氣相色譜法測定瑞舒伐他汀鈣合成中間物料的有機溶劑殘留

斯智萍，徐世芳

（1.浙江核力欣健藥業有限公司，浙江 湖州 313000； 2.杭州醫學院，浙江 杭州 310013）

瑞舒伐他汀鈣為全化學合成藥，自日本鹽野義制藥株式會社首次研發成功（專利號：JP5178841B）以來，不少生產廠家研究出了不同的合成工藝路線。其中，英國阿斯利康公司（獲得該藥的技術轉讓）率先提出了將嘧啶母核做成磷鹽，將叔丁酯做成側鏈醛，然后經Wittig反應縮合得到瑞舒伐他汀骨架，再經脫保護、堿水解而轉化成鈣鹽，從而得到瑞舒伐他汀鈣[1－4]。該經典合成線路中，叔丁酯側鏈醛[（4R－順式）－6－醛基－2，2－二甲基－1，3－二氧己環－4－乙酸叔丁酯]作為關鍵的中間物料逐漸市場化，分析其合成工藝，該產品可能殘留乙醇、乙醛、甲苯、二甲硫醚等有機溶劑。為考察所購叔丁酯側鏈醛的質量，進一步控制瑞舒伐他汀鈣的產品質量，本研究中采用頂空氣相色譜法對叔丁酯側鏈醛中的乙醇、乙醛、甲苯、二甲硫醚的殘留進行了考察，并進行了方法學研究，以期為瑞舒伐他汀鈣合成中間物料的質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7890A型氣相色譜儀、7697A型頂空進樣器（美國Agilent公司）；QP 2010 Ultra/SE型氣質聯用儀（日本Shimadzu公司）；XPE205型電子天平（瑞士Mettler公司）。

1.2 試藥

乙醇（色譜純，批號為K48709227），二甲基亞砜（色譜純，批號為10956900），均購自Merck KgaA公司；乙醛（Aladdin Industrial Corporation，批號為20181208，含量為99%）；二甲硫醚（西格瑪奧德里奇＜上海＞貿易有限公司，批號為20180706，含量≥99.0%）；甲苯（杭州雙林化工試劑廠，批號為20141008，含量≥99.5%）；（4R－順式）－6－醛基－2，2－二甲基－1，3－二氧己環－4－乙酸叔丁酯樣品（江蘇某制藥有限公司，物料代號為DK001Y－SM2，批號為SQ－D7－160701）。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為以6%氰丙基苯基－94%二甲基聚硅氧烷為固定相的Rtx－624毛細管柱（60 m×0.25 mm，1.4μm），程序升溫（初始溫度為60℃，保持15 min，以40℃/min的速率升至240℃，保持5 min）；火焰離子化檢測器，檢測器溫度為250℃，進樣口溫度為200℃，分流比為30∶1，載氣為氮氣；頂空進樣，平衡溫度為90℃，平衡時間為30 min，定量環溫度為120℃，傳輸線溫度為130℃；進樣量為1 mL。

質譜條件：GCMSSolution 2.71工作站；電子轟擊（EI）離子源，離子源溫度230℃，傳輸線溫度250℃；掃描模式Full Scan，質量掃描范圍m/z為45～550。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：稱取乙醇、乙醛、二甲硫醚及甲苯對照品各適量，精密稱定，加二甲基亞砜溶解，制成每1 mL約含乙醇50 mg、乙醛38.5 mg、甲苯9 mg及二甲硫醚10 mg的混合對照品貯備液；逐級稀釋，制成每1 mL含乙醇0.5 mg、乙醛0.385 mg、甲苯0.09 mg及二甲硫醚0.1 mg的混合對照品溶液。

供試品溶液：稱取樣品0.5 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，精密加入5 mL二甲基亞砜，即得，壓蓋密封。

空白溶劑：以二甲基亞砜作為空白溶劑。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：精密量取混合對照品溶液、空白溶劑及100%限度濃度加標供試品溶液各5.0 mL，分別置20 mL頂空瓶中，壓蓋密封。按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄氣相色譜圖。結果空白溶劑對樣品測定無干擾，供試品溶液中含有多個其他未知峰，但所測溶劑乙醛、乙醇、二甲硫醚及甲苯峰與各相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。詳見圖1。

圖1 典型氣相色譜圖1.acetaldehyde 2.ethanol 3.dimethyl sulfide 4.tolueneA.Blank solvent B.Mixed reference solution C.Spiked test solutionFig.1 Typical GC chromatograms

線性關系考察：精密量取混合對照品貯備液0.2，0.5，0.8，1.0，1.2，2.0 mL，分別置100 mL容量瓶中，用二甲基亞砜定容，即得殘留溶劑系列混合對照品溶液。各精密量取5 mL，置20 mL頂空瓶中，壓蓋密封。按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標、各待測成分質量濃度為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程及線性范圍。結果見表1。

表1 線性關系考察結果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test（n=6）

精密度試驗：精密量取混合對照品溶液5 mL，置20 mL頂空瓶中，平行制備6份，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果乙醛、乙醇、二甲硫醚及甲苯峰面積的RSD均小于10.0%（n=6），表明儀器的精密度良好。

檢測限與定量限考察：將2.2項下混合對照品溶液逐級稀釋，分別以信噪比（S/N）為3和10時的質量濃度作為檢測限和定量限。進樣分析，記錄氣相色譜圖，測得乙醛、乙醇、二甲硫醚及甲苯的檢測限和定量限（見表2）。定量限的精密度RSD均小于10%（n=6），表明該方法靈敏度好。

表2 檢測限與定量限檢測結果Tab.2 Results of LOD and LOQ

回收率試驗：取混合對照品貯備液0.8，1.0，1.2mL，分別置100 mL容量瓶中，配制低、中、高3種質量濃度（各溶劑限度的80%，100%，120%）的混合對照品溶液。取樣品0.5 g，置20 mL頂空瓶中，分別精密加入3種不同濃度的混合對照品溶液各5.0 mL，每種濃度各制備3份。按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，按外標法計算回收率。結果見表3至表6。

表3 乙醛回收率試驗結果（n=9）Tab.3 Results of the recovery test of acetaldehyde（n=9）

表4 乙醇回收率試驗結果（n=9）Tab.4 Results of the recovery test of ethanol（n=9）

表5 二甲硫醚回收率試驗結果（n=9）Tab.5 Results of the recovery test of dimethyl sulfide（n=9）

表6 甲苯回收率試驗結果（n=9）Tab.6 Results of the recovery test of toluene（n=9）

2.4 樣品含量測定

取樣品0.5 g，依法制備供試品溶液，平行2份，按2.1項下試驗條件進樣檢測，記錄色譜圖（見圖2）。結果供試品溶液中乙醛、乙醇、二甲硫醚、甲苯的含量分別為0.002%，0.008%，0.001%，0.005%。

圖2 供試品溶液氣相色譜圖1.acetaldehyde 2.ethanol 3.dimethyl sulfide 4.tolueneFig.2 GC chromatograms of test solution

為進一步鑒定樣品中未知溶劑峰，按2.1項下試驗條件，對供試品溶液進行氣相色譜串聯質譜（GC－MS）分析，結果見圖3。結合NIST譜庫檢索功能，扣除空白溶劑峰的干擾，對供試品溶液中較大的10個未知峰進行結構歸屬，鑒定結果見表7。

表7 供試品溶液中10種鑒定的未知化合物結構信息表Tab.7 Structure information of 10 unknown compounds identified in the test solution

圖3 供試品溶液氣相色譜串聯質譜總離子流圖Fig.3 Total ion flow of test solution by GC-MS/MS

3 討論

3.1 進樣方式選擇

氣相色譜的進樣方式有直接進樣及頂空進樣。直接進樣快速、方便、準確，頂空進樣溫度較低，可避免樣品熱解損失及非揮發性物質對進樣口和毛細管柱的污染[5－9]。預試驗中，樣品在直接進樣－氣相色譜分析中，主成分有較大響應，導致某些殘留溶劑可能被包裹在主成分中而漏檢，故最終選擇頂空進樣方式。

3.2 溶劑選擇

頂空氣相色譜法選用的溶劑多為水，但由于該中間物料不溶于水，故先后考慮了溶解能力較強的二甲基亞砜及二甲基甲酰胺。待測殘留溶劑甲苯的沸點較高，出峰靠后，為了不干擾測定，最終選擇了二甲基亞砜。

3.3 頂空條件選擇

預試驗中采用單因素考察方法確定了最佳平衡時間和平衡溫度。固定平衡時間，考察不同平衡溫度（70，80，90，100℃）下待測成分響應值的變化，發現隨著溫度的升高，待測成分響應值增加，但由于90℃與100℃的響應值無明顯差異，考慮溫度過高可能使樣品發生熱解，故選擇平衡溫度為90℃。固定平衡溫度，考察不同平衡時間（20，25，30，35 min）對待測成分響應值的影響，發現平衡30 min后再繼續延長平衡時間，待測成分的響應值并無明顯增加，故選擇平衡時間為30 min。

3.4 頂空瓶溶劑體積選擇

頂空體積的大小對檢測靈敏度、精密度有重要影響[10]。預試驗中分別考察了溶劑體積為1，3，5，7 mL時待測成分響應值的變化。結果發現，當溶劑體積小于頂空瓶體積的1/3時，隨著溶劑體積的增加，響應值增加；溶劑體積為7 mL時的響應值與5 mL時無明顯差異，且精密度略有降低，故將溶劑體積確定為5 mL。

3.5 供試品中其他未知溶劑峰的鑒定

為進一步鑒定樣品中的未知溶劑峰，采用GC－MS法對供試品溶液中較大的10個未知峰進行了結構鑒定。由于樣品為供應商提供的工藝研究批次樣品，對乙醛、乙醇、二甲硫醚和甲苯等4種殘留有機溶劑測定的目的，只是為供應商提供一種有機溶劑殘留量測定參考方法，故未對鑒定出的10種含量較大的溶劑峰做進一步追溯。后續需與物料供應商接洽反饋該試驗結果，建議其從生產工藝及試驗溶劑著手，在生產過程中加上溶劑清洗的步驟，對該物料做進一步純化處理，并要求供應商對優化工藝再行分析，根據實際情況對殘留溶劑進行定量控制，做好中間物料的控制。

3.6 方法評價

本研究中通過對溶劑、頂空平衡時間及平衡溫度等條件的優化試驗，建立了對測定瑞舒伐他汀鈣合成中間物料（4R－順式）－6－醛基－2，2－二甲基－1，3－二氧己環－4－乙酸叔丁酯中的乙醛、乙醇、二甲硫醚及甲苯等4種有機溶劑殘留量的頂空氣相色譜法。該方法操作簡便，靈敏度高，準確度好，各組分間的分離度較好。該研究為復雜樣品基質中有機溶劑殘留量的測定提供了參考，為供應商對該物料的生產純化提供了方向。