四鮮湯鮮藥汁對急性粒 -單核白血病細胞WEHI-3小鼠模型的影響

張 瑾，康 樂，李秀敏，苗明三

（1.河南中醫藥大學 藥學院，鄭州 450000；2.紐約醫學院 微生物和免疫學科，紐約 10595）

急性粒 單核細胞白血病是一種由于粒細胞和單核細胞兩系同時發生惡性增生的急性白血病。在臨床中約占急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）發病人數的15%［1］，具有緩解率低、易復發的特點［2］。AML在中醫學中屬于“熱勞”“溫病”“血證”“痰核”“瘰疬”“癥瘕”“積聚”“虛勞”等范疇，在治療中應以清熱解毒為根本［3］。

四鮮湯是由鮮生地、鮮小薊、鮮蒲公英、鮮白茅根4味藥組成，具有養陰清熱、涼血解毒、寧絡止血之功。在服用時，將鮮藥洗凈切碎，直接取汁飲用，可以治療由陰虛內熱引起的各種血液病和出血性疾病［4］。

本實驗主要以四鮮湯鮮藥汁為研究對象，采用急性粒單核白血病細胞（WEHI-3細胞）制備AML小鼠模型，觀察四鮮湯鮮藥汁對AML動物模型的影響，并探討其抑制作用，為四鮮湯鮮藥應用于治療白血病提供了理論及實驗基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

雄性BALB／c小鼠，18～21 g，購自山東省濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK（魯）20190003，動物合格證號：1107261911002008，實驗前小鼠適應環境至少1周。將小鼠（每組12只）置于塑料籠中，12 h光－照循環（23℃，（55±5）%濕度）下，自由飲水。所有涉及動物的實驗程序均經河南中醫藥大學倫理委員會批準，實驗動物使用許可證號：SYXK（豫）2015－0005。

1.2 實驗藥品

四鮮湯：鮮地黃150 g，鮮蒲公英、鮮小薊、鮮白茅根各300 g；將以上4味藥稱重，除去雜質，洗凈，將其切成3～5 mm的片或段，用榨汁機榨取鮮藥汁后再次稱重，計算鮮藥比例折算用量，得四鮮湯鮮藥汁（本實驗所采用的鮮地黃1 g相當于鮮地黃汁1.14 mL；鮮蒲公英1 g相當于鮮蒲公英汁1.83 mL；鮮小薊1 g相當于鮮小薊汁1.60 mL；鮮白茅根1 g相當于鮮白茅根汁2.98 mL），即鮮地黃汁171.06 mL、鮮蒲公英汁547.68 mL、鮮小薊汁481 mL、鮮白茅根汁895.8 mL。消癌平片（陽性對照藥），購于長春銀諾克藥業有限公司，批號：20190801。

1.3 實驗試劑與儀器

DMEM高糖培養基，北京索萊寶科技有限公司，批號：20191011；Lonsera南美胎牛血清，上海雙洳（思洳）生物科技有限公司，批號：OH12343；青鏈霉素混合液，北京索萊寶科技有限公司，批號：20190712；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，北京索萊寶科技有限公司，批號：20190506；Hyclone磷酸鹽緩沖溶液（PBS）批號：AE29042298；FITC anti-mouse CD3抗體，美國BioLegend公司，批號：B291431；PEanti-mouse CD19抗體，美國BioLegend公司，批號：B288652；PE anti-mouse／human CD11b抗體，美國BioLegend公司，批號：B294977；FITC anti-mouseCD107b（Mac-3），美國BD BIOSCIENCES PHARMINGEN公司，批號：9050953；小鼠白細胞介素2（IL-2）ELISA檢測試劑盒，蘇州卡爾文有限公司，批號：E20200501A；小鼠白細胞介素3（IL-3）ELISA檢測試劑盒，蘇州卡爾文有限公司，批號：E20200501；小鼠干擾素γ（IFN-γ）ELISA檢測試劑盒，蘇州卡爾文有限公司，批號：E20200501；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒，蘇州卡爾文有限公司，批號：2411639601。

BIO-RAD680酶標儀（美國BIO-RAD公司）；Forma 371 CO2細胞培養箱，美國ThermoFisher Scientific公司；CytoFLEX流式細胞儀，美國Beckman公司；Coutstar細胞分析儀，上海睿鈺生物科技有限公司；BX63-CellSens全電動智能顯微鏡，日本Olympus公司；H2050R臺式高速大容量冷凍離心機（湖南湘儀開發有限公司）；DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海－恒科學儀器有限公司）；Wellwash Versa雙排全自動洗板機，美國ThermoFisher Scientific公司。

1.4 白血病細胞株和細胞培養

WEHI-3小鼠白血病細胞，購于Otwo Biotech（ShenZhen），貨號：HTX2665。細胞用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養基，在5%飽和濕度的無菌恒溫培養箱培養，隔天傳代1次。

2 實驗過程

1）模型制備

體外培養WEHI-3細胞，待細胞進入對數生長期后進行擴增，收集細胞后以PBS重懸并計數，調整細胞密度至5×106個／mL，取60只BALB／c小鼠，雄性，SPF級，8～10周齡，體重20～22 g，每只小鼠腹腔注射0.2 mL細胞懸液，即每只小鼠接種1×106個WEHI-3細胞。

2）給藥方法

隨機分為5組，即：模型組（WEHI-3）、陽性對照組（消癌平，2.25 g／kg，0.1 mL／10 g）、四鮮湯汁低劑量組（24.5 g／kg，相當于臨床劑量的7.5倍，0.4 mL／10g）、四鮮湯汁中劑量組（49 g／kg，相當于臨床劑量的15倍，0.4 mL／10g）、四鮮湯汁高劑量組（98 g／kg，相當于臨床劑量的30倍，0.4 mL／10 g），每組12只，先接種白血病細胞，接種10 d后各組灌胃相應藥物。另設12只空白對照組，同模型組每日給予等量溶媒，0.2 mL／只，每日1次，連續14 d。

3 指標檢測

1）表觀指標觀察

給藥期間每日觀察各組小鼠的一般精神狀態、進食情況、體重等方面的變化。

2）細胞因子檢測

末次給藥1 h后，小鼠眼眶取血，4℃離心（3 500 rpm）10 min，收集上清，用細胞因子酶聯免疫檢測試劑盒檢測樣本中的白細胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白細胞介素-3（Interleukin-3，IL-3）、γ干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量。具體方法按試劑盒說明進行。450 nm波長處讀取光密度值。各細胞因子濃度參照已知濃度標準品繪制的標準曲線判定。

3）白細胞表面標記物檢測

末次給藥后，對所有小鼠進行稱重，眼眶抗凝取血，與肝素混勻后置于室溫，取抗凝全血100 μL，每管加入室溫紅細胞裂解液4 mL，充分混勻，室溫靜置3 min。1 000 rpm離心5 min，棄上清。用PBS洗滌2次，每次4 mL，1 000 rpm離心5 min，棄上清。用100μL PBS重懸細胞，加入熒光標記抗體，混勻，4℃避光孵育40 min。每組分別設置空白和單標。用PBS洗滌2次，每次4 mL，1 000 rpm離心5 min，棄上清。用200μL PBS重懸細胞，4℃避光放置，2 h內流式細胞儀檢測細胞標志物百分率。

4）脾臟病理觀察

各組小鼠處死后，取出小鼠的脾臟，4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片后進行H＆E染色，在光鏡下觀察其病理學變化。

5）統計學處理

用SPSS21.0 for windows對數據加以分析，實驗結果以平均值±標準差（±s）的形式表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差不齊者用Games-Howell法，齊者用LSD法，等級資料采用Ridit檢驗。

4 結果

4.1 各組小鼠體質量情況

空白組小鼠體重平穩增長，毛發正常，精神良好，行為活躍。與空白組比，模型組小鼠隨著造模時間增加，體重有明顯增加的趨勢（P＜0.05或P＜0.01），可能是由于腹腔形成腫瘤和腹水的原因：表現為弓背蜷縮、聚團、皮毛枯萎、精神萎靡、活動減少等體征。與模型組比較，各給藥組小鼠弓背蜷縮、聚團、皮毛枯萎、精神萎靡、活動減少等體征均有改善；給藥第5 d，與模型組相比，四鮮湯汁中劑量組小鼠體重明顯下降（P＜0.05）；給藥第9 d，與模型組相比，消癌平組、四鮮湯汁中劑量組小鼠體重明顯下降（P＜0.05）；給藥第14 d，與模型組相比較，四鮮湯汁中劑量組小鼠體重顯著下降（P＜0.01），消癌平組小鼠體重明顯下降（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組小鼠體質量情況折線圖（±s，n＝12）

4.2 各組小鼠血清IL-2、IL-3、IFN-γ和TNF-α的含量

圖2為各組小鼠血清IL-2、IL-3、IFN-γ和TNFα的含量。

圖2 各組小鼠血清IL-2、IL-3、TNF-α和IFN-γ的含量（±s，n＝12）示意圖與空白組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05，；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

由圖2可知：與空白組相比，模型組小鼠血清中IL-2顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，消癌平和四鮮湯汁各劑量可顯著升高小鼠血清中IL-2的水平（P＜0.01）。與空白組相比，模型組小鼠血清中IL-3顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，四鮮湯汁低劑量組可明顯升高小鼠血清中IL-3水平（P＜0.05），四鮮湯汁各劑量均能夠不同程度升高小鼠血清中IL-3的水平。與空白組相比，模型組小鼠血清中TNF-α有所降低；與模型組相比，四鮮湯汁低、中劑量組可顯著升高小鼠血清中TNF-α的水平（P＜0.01）；四鮮湯汁高劑量組也可明顯升高小鼠血清中TNF-α的水平（P＜0.05）。與空白組相比，模型組小鼠血清中IFN-γ顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，四鮮湯汁中、高劑量可顯著升高小鼠血清中IFN-γ的水平（P＜0.01）；四鮮湯汁低劑量組也可明顯升高小鼠血清中IFN-γ的水平（P＜0.05）。

4.3 各組小鼠白細胞表面標志水平

本研究通過CD11b分子、Mac-3分子、CD3和CD19檢測各組小鼠白細胞表面標志水平（圖3）。模型組小鼠的CD11b水平明顯升高（P＜0.05），與模型組相比，消癌平組和四鮮湯汁各劑量組的CD11b均有下降趨勢，其中四鮮湯汁低劑量較之模型組明顯下降（P＜0.05），四鮮湯汁中、高劑量的CD11b水平顯著下降（P＜0.01）。模型組小鼠Mac-3水平顯著升高（P＜0.01），四鮮湯汁低劑量的Mac-3水平較之模型組明顯下降（P＜0.05），消癌平組、四鮮湯汁中、高劑量的Mac-3水平顯著下降（P＜0.01）。此外，與模型組相比，消癌平組和四鮮湯汁各給藥組小鼠的CD3和CD19的水平均比模型組升高，與空白組相比，模型組小鼠CD3的比率均顯著降低（P＜0.01），其中消癌平組和四鮮湯汁低劑量的CD3比率明顯升高（P＜0.05），四鮮湯汁中、高劑量組則顯著升高（P＜0.01）。模型組小鼠CD19的比率顯著降低（P＜0.01）。四鮮湯汁低劑量組的CD19比率明顯升高（P＜0.05），消癌平組、四鮮湯汁中、高劑量組的CD19也有升高趨勢。

圖3 白細胞表面分子標志（±s，n＝12）直方圖與空白組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05，；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

4.4 脾臟病檢

圖4為各組小鼠脾臟病理變化情況，由圖4可知，空白組小鼠脾臟正常，結構完整，紅白髓間界限清楚，脾小體結構清晰。模型組小鼠脾臟紅白髓間界限模糊，脾臟的淋巴細胞減少。消癌平組脾臟的淋巴細胞較模型組多。四鮮湯鮮藥汁的低、中、高劑量組脾臟正常，脾小體結構清晰，組織結構完整，淋巴細胞較模型組多，提示細胞的免疫功能增強。

圖4 各組小鼠脾臟病理圖

5 結果與討論

急性髓系白血病是最常見的急性白血病，多數病例發病迅猛，預后較差。目前主要治療方案為化療和造血干細胞移植，但經常會出現化療效果不理想、毒副作用較大、容易復發等情況［5］。目前AML的發病機制尚未完全清楚，現有研究表明其誘因有物理、化學、生物及遺傳因素等。免疫功能異常也會增加發生AML的風險［6－7］。

鮮藥具有活性成分含量高、療效好的特點［8］。在臨床上最常見的應用鮮藥的方法是自然汁服用，這種方式能保持藥物天然的活性成分［9］，適用于急危重癥、外感熱病、邪熱熾盛或化火傷陰等病癥的治療。現代中醫學認為急性髓系白血病是由于正氣虛損與邪毒內侵并舉，正邪相爭，久病則虛，毒在骨髓、氣血津液傳變，致使臟腑氣血功能受損失調，氣血虧耗，內虛為本，病情反復。治療原則應以本虛標實為根本，或邪盛正虛、正虛邪伏、正勝邪退［10］。四鮮湯中鮮生地在生理活性上對中樞神經系統、心腦血管系統、免疫系統等有明顯的作用，并具有抗骨質疏松、抗炎等藥理作用［11］；鮮小薊的藥理作用包括止血凝血、抗菌抗炎、抗癌等［12］；鮮蒲公英在抗炎、抗腫瘤、抑菌、抗病毒、抗氧化、胃腸保護、利尿等方面有顯著的藥理活性［13］；鮮白茅根具有免疫調節、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、止血、調節脂質代謝等藥理作用［14］。中醫藥治療急性白血病具有一定的特色和優勢，目前已有研究證實四鮮湯治療急性白血病具有良好療效［15］。

本實驗結果表明：四鮮湯鮮藥汁可改善模型小鼠的活動情況，不同程度的升高小鼠血清IL-2、IL-3、IFN-γ和TNF-α的含量，其中IL-2屬于Th1細胞因子，具有增強Th1免疫反應的能力，介導激活CD8＋CTL細胞，產生致炎性細胞因子，增強NK細胞活性，從而發揮抗細菌、抗病毒和抗腫瘤的作用［16－17］；IL-3由受到抗原刺激而被活化的輔助T細胞產生，是反應產生的炎癥性細胞因子，具有造血和免疫調節的作用［18－19］；IFN-γ具有較強的抗腫瘤免疫調節功能，治療后的小鼠IFN-γ升高說明了四鮮湯鮮藥汁可以提高免疫功能，激活機體的免疫狀態［20－21］；TNF-α具有抗腫瘤作用，是重要的免疫調節因子，與機體的炎癥、免疫反應有密切關系［22－23］，證明了四鮮湯鮮藥汁可以調節免疫功能，刺激細胞發揮抗腫瘤作用。四鮮湯鮮藥汁治療組降低了CD11b和Mac-3的水平，升高CD3和CD19的水平。CD11b在正常情況下，主要在成熟單核細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞上表達，其主要功能是促進炎癥的發生和發展，促進吞噬細胞的吞噬功能等，在機體的抗感染免疫中發揮重要作用［24］。CD3是成熟T淋巴細胞，表示人體細胞免疫功能狀態，其水平升高表示了機體識別和殺傷腫瘤細胞的能力上升［25］。CD19參與B細胞的增殖、分化、活化及抗體產生，可以促進BCR的信號轉導［26］，這些結果證明了四鮮湯鮮藥汁提高了T、B細胞的增殖能力，從而抑制了單核細胞和巨噬細胞的增殖［27］，增強了機體的抗腫瘤能力。并且四鮮湯鮮藥汁能明顯改善脾臟的病理變化，并未造成機體的肝損傷。

本實驗證明了四鮮湯鮮藥汁對AML有較好的治療作用，為鮮藥在現代應用中的進一步發展提供了實驗基礎。