納豆激酶對大鼠腦血栓的溶栓作用研究

鄭立娟 陳小婕 楊巖 史新龍 吳燾 張生琰

納豆激酶(NK)是一種納豆菌在發酵過程中由枯草芽孢桿菌分泌生成的具有高效溶栓效果的纖維蛋白酶，具有抗血栓、抗菌、抗氧化、降血壓、降血脂等多種作用[1]。目前，臨床常見的急性心肌梗死、腦血栓中風、脈管栓塞等多種嚴重的心血管疾病均由血栓引發，這些疾病好發于中老年人群，對中老年患者的身體健康構成極大的威脅[2]。據報道，全球范圍內目前有1 500萬以上的血栓患者，溶栓劑的潛在市場值達20億美元之多[3]。然而臨床上常用的鏈激酶、尿激酶、重組組織型纖溶酶原激活物等溶栓劑均存在價格昂貴、副作用大、半衰期短等缺點，制約了在臨床上的廣泛應用。NK具有溶栓效果好、起效快、體內半衰期長、安全性好、成本低等優點，有用于開發新型溶栓劑的潛力[4]。NK溶栓作用有幾種不同的給藥方式，各自有各自的優點[5]。本實驗探討通過十二指腸給藥的途徑應用NK對大鼠腦血栓的溶栓作用，結果如下。

1 實驗材料

1.1 動物 wistar大鼠，雄性，體質量360～450 g。

1.2 儀器 ①醫用牙科鉆。②漩渦混合器，型號：QL-901，由上海市麒麟醫用儀器廠生產。③振蕩培養箱，型號：SPX-250B-D型，由上海博訊實業有限公司醫療設備廠生產。

1.3 藥物試劑 ①納豆激酶凍干粉(NK酶粉)，由北京孚曼生物技術有限公司提供，比活性：275 FU/mg，批號：20110321，HPLC純度：83.66%，蛋白含量：24.4%(其余為NaCl)。保存方法：-20 ℃密封保存。②戊巴比妥鈉，規格：25 g，產品批號：F20030816，中國醫藥(集團)上海化學試劑公司。③聚山梨酯80(吐溫80)，規格：500 g，批號：101212M，為上海申宇醫藥化工有限公司產品。④大豆油(藥用級)，規格：1 L，批號：09050101，由鐵嶺北亞藥用油有限公司提供。⑤紅四氮唑(TTC)，規格：10 g，批號：2010512，為上海中秦化學試劑有限公司產品。

2 實驗方法

2.1 實驗藥物的配法 ①50%FeCl3溶液的配制。36.5%的HCl 1 mL，加于9 mL雙蒸水得到1 mmol/L的HCl 10 mL。稱取FeCl35g，將FeCl3溶于1 mmol/L的10 mL HCl中，即得到50% FeCl3溶液。FeCl3·6H2O規格：500 g，批號：100325，為天津市光復科技發展有限公司產品。36.5% HCl規格：500 mL，批號：100302，為白銀市良友化學試劑公司產品。②2%紅四氮唑(TTC)的配制。0.2 M pH 7.6的PBS緩沖液20 mL，加入TTC 0.4 g。TTC避光保存，臨用前配制。③0.3%戊巴比妥鈉的配制。稱取0.3 g的戊巴比妥鈉，溶于100 mL生理鹽水即可。④溶媒配制。取46.5 mL大豆油(藥用級)與3.5 mL聚山梨酯80混勻即可，其中聚山梨酯80濃度為7.0%(V/V)。⑤納豆激酶油溶液配制。稱取145.6 mg納豆激酶凍干粉，加溶媒到10 mL后混勻，即得納豆激酶油溶液(4 000 FU/mL)。每只大鼠體質量約400 g，每只給NK油溶液1 mL，含藥4 000 FU。

2.2 實驗動物分組 將24只wistar大鼠按體質量隨機分為兩組：模型對照組和NK組，每組各12只。2.3 給藥方案 模型對照組：給等容量溶媒(2.5 mL/kg)，同時給生理鹽水2.5 mL/kg。NK 組：10 000 U/kg(2.5 mL/kg，4 000 FU/mL，14.56 mg/mL)，同時給生理鹽水2.5 mL/kg。

2.4 模型制備方法[6]用0.3%戊巴比妥鈉按1 mL/100 g腹腔內注射，麻醉后右側位固定，沿左眼外眥與外耳道連線的中點做一長約2 cm的垂直切口，鈍性分離顴肌，咬去顴弓，撐開下頜關節，在顴弓根部前下方0.2 cm處用牙科鉆打薄骨質，牙科探針挑去骨片，開一約4 mm×3 mm的骨窗，可見大腦中動脈(MCA)沿嗅束垂直方向走行。取長約3 mm浸于50% FeCl3溶液的1號線，帖于MCA中段(位于嗅束與大腦中靜脈之間)，每次帖線7.5 min，共四次，30 min。最后，生理鹽水沖洗創面，依次縫合組織、皮膚。

2.5 給藥方法 大鼠在MCA血栓形成術后立即經十二指腸給藥一次，觀察藥物的治療作用。

2.6 神經癥狀的評分標準[7]術后24 h按神經學評分標準來評價神經功能。神經學評分標準為：總分11分；尾部倒提時，患側上肢內收，評為2分；肩外旋，評為2分；向對側推左(右)上肢，患側抵抗力下降，評為1～3分；將上肢置金屬網上，患側肢肌張力下降，評為1～3分；向患側旋轉，評為1分。

2.7 染色方法及腦梗死面積的計算 術后24 h將大鼠斷頭處死，取出大腦組織，置于-20 ℃冰箱15 min，待其凍硬后，用刀片將大腦沿冠狀面切成5片，置于2% TTC溶液中，37℃孵育30 min。取出腦片，按組織學順序鋪平后拍照，用Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統軟件計算梗死灶面積。

2.8 腦含水量的計算 拍照后分別稱取左、右側(患側和正常側)大腦濕重，置于60 ℃溫箱72 h，烘干至恒重，稱干重計算兩側腦含水量。腦含水量(%)＝(濕重-干重)/濕重×100%。

2.9 統計學處理 采用SPSS 23.0統計軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 兩組大鼠腦片染色后圖片 治療后，NK組腦切片中下部白色梗死區域面積明顯小于模型對照組，見圖1～2。

圖1 模型對照組

圖2 NK組

3.2 NK對FeCl3誘導大鼠MCA血栓形成腦梗死面積的影響比較 與模型對照組相比，NK組的腦梗死面積和神經系統癥狀評分均明顯偏小，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見表1。3.3 NK對FeCl3誘導大鼠MCA血栓形成術后腦含水量的影響比較 模型對照組和NK組的患側腦含水量均明顯高于正常側腦含水量，差異均具有統計學意義(P＜0.05)；模型對照組和NK組的患側腦含水量比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表1 NK對FeCl3誘導大鼠MCA血栓形成腦梗死面積的影響比較(±s)

表1 NK對FeCl3誘導大鼠MCA血栓形成腦梗死面積的影響比較(±s)

?組別 例數 梗死面積(%) 神經系統癥狀評分(分)模型對照組 12 6.67±1.02 7.17±1.40 NK組 12 5.45±0.78 5.92±1.01 t值 3.291 2.508 P值 0.002 0.010

表2 NK對FeCl3誘導大鼠MCA血栓形成術后腦含水量的影響比較(±s) 單位：%

表2 NK對FeCl3誘導大鼠MCA血栓形成術后腦含水量的影響比較(±s) 單位：%

組別 例數 患側腦含水量正常側腦含水量 t配對值 P值模型對照組 12 76.73±1.10 75.49±0.95 2.955 0.004 NK組 12 76.27±0.85 75.17±1.19 2.606 0.008 t值 1.146 0.728 P值 0.132 0.237

4 討論

近年來，血栓癥已逐漸成為死亡率居于首位的疾病，嚴重威脅中老年人群的身體健康[8]。應用溶栓藥物來溶解血栓是治療血栓癥的主要手段。尿激酶、鏈激酶等屬于第一代溶栓藥物，對纖維蛋白無特異性的選擇作用，因此有半衰期短、出血傾向等缺點[9]。重組單鏈尿激酶、葡激酶、鏈激酶復合物、組織型纖溶酶原激活劑等屬于第二代溶栓藥物，其纖溶作用強于第一代藥物，然而仍然存在半衰期短、纖維蛋白特異性低、要求大劑量持續用藥、成本高等缺點[10]。基于此，研發新型有效的溶栓藥物具有重要的臨床意義。NK是能夠直接溶解纖維蛋白的一種纖溶酶，近年來成為溶栓藥物關注的焦點[11]。NK于1987年由Sumi等日本學者首次發現，通過納豆發酵所得，能夠明顯的溶解體外血栓，縮短優球蛋白的溶解時間，有潛力成為新型的溶栓藥物[12]。本研究探討通過十二指腸給藥的途徑應用NK對大鼠腦血栓的溶栓作用，以期為NK在臨床上應用于抗血栓治療提供實驗依據。

本研究結果顯示，與模型對照組相比，NK組的腦梗死面積和神經癥狀24 h評分均明顯偏小，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。提示NK經十二指腸給藥能夠明顯減小大鼠腦梗死面積，改善神經系統損傷。研究表明，NK從以下四個方面發揮溶栓作用：①溶解纖維蛋白，從而直接溶解血栓。②改善尿激酶原的空間結構，從而激活尿激酶，發揮溶解血栓的作用。③刺激tPA的生成來溶解血栓。④降解纖維酶原激活劑的抑制劑來間接溶解血栓[13]。有文獻報道[14]，機體有獨立的轉運系統來轉運蛋白質的消化產物-小肽，且其轉運效率與小肽轉運蛋白(PepT1)在腸道中的分布密切相關，而十二指腸中PepT1廣泛分布。研究認為，十二指腸中的肽酶能夠將NK水解為9個小肽，從而有利于小腸全段對NK的充分吸收[15]。另外本研究結果顯示，模型對照組和NK組的患側腦含水量均明顯高于正常側腦含水量，差異均具有統計學意義(P＜0.05)；模型對照組和NK組的患側腦含水量比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。這可能是由于FeCl3和HCl的化學刺激導致兩組大鼠腦組織充血水腫甚至壞死，在術后24 h取腦時，發現兩組均有大鼠患側腦組織缺損，這直接導致患側腦含水量數值較正常側高。此外在本實驗實施的過程中發現，NK在含7.0%的吐溫80的大豆油中的溶解性不好，這會導致給藥過程中部分藥物丟失的風險，因此在后續的研究中需要探索新的溶媒來溶解NK，以提高給藥的準確性。

綜上所述，NK經十二指腸給藥能夠明顯減小大鼠腦梗死面積，改善神經系統損傷。