墊狀卷柏提取物對人白血病細胞K562誘導凋亡的研究

張應

近年來藥理學研究表明墊狀卷柏具有多種藥理學活性，其中抗腫瘤活性具有特異性得到關注和重視[1-3]。本課題組前期對墊狀卷柏提取物(Selaginelpulvinate extracts，SP) 的抗腫瘤活性進行系統性的篩選，發現SP對人白血病細胞系K562的體外細胞增生抑制作用最強，為進一步研究其作用機制，筆者開展了SP對K562腫瘤細胞作用機制的研究，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及藥材 K562腫瘤細胞由中國科學院基礎醫學研究院細胞庫提供。墊狀卷柏購于安徽亳州滕王藥業有限公司，批號為1907003，為全草干燥狀態。

1.2 試劑 RPMI-1640培養液(Gibco)；胰蛋白酶(Sigma)；膜聯蛋白V/碘化吡啶(Annexin V/PI)試劑盒(BD)；滅菌胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)；無水乙醇(國藥化試)。

1.3 儀器 超聲波清洗儀(KQ-500，昆山市超聲儀器有限公司)；CO2細胞培養箱(美國Thermofisher公司)；生物安全柜(美國LABCONCO公司)；CKX41型倒置光學顯微鏡(Olympus公司)；FACsc-alibur型流式細胞儀(Beeton-Diekinson公司)；臺式離心機(Anke TDL-40型，上海安亭科學儀器廠)；壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KB，安海申安醫療器械廠)。

1.4 SP的制備 稱取適量墊狀卷柏干燥的全草，粉碎過40目篩備用。稱取100 g狀卷柏干燥全草粉末，以75%乙醇作為提取溶劑(料液比1∶20)，浸提24 h后，超聲提取20 min，提取溫度40 ℃，真空抽濾后濾渣重復上操作2次，最后合并濾液，旋蒸濃縮后并減壓干燥成干粉。實驗臨用前用75%乙醇溶解得到高濃度的母液，0.22 μm濾膜過除濾后待用，給藥時用PBS溶液稀釋至所需的濃度。最高給藥濃度組所用的藥液中乙醇濃度均小于0.3%，預實驗表明含0.3%乙醇的PBS組與PBS空白組相比較，對本研究所涉及腫瘤細胞株的吸光度均差異無統計學意義(P＞0.05)，說明含0.3%乙醇的PBS對本研究中所有腫瘤細胞株的增生無影響。

1.5 SP對腫瘤細胞凋亡的檢測 取對數生長期的人慢性髓系K562腫瘤細胞，重懸后以5×105個/mL濃度接種于6孔板中培養24 h后吸棄原培養液，加入90 μL新鮮培養液和10 μL 不同濃度的SP 溶液，每組設3個復孔并另設PBS空白對照組。繼續培養36 h后，收集各組細胞，用PBS洗滌2次，懸于結合緩沖液中，調整細胞濃度至1×106個/mL；先加入5 μL Annexin V試劑，混合均勻，然后再加入5 μL PI試劑，混合均勻，孵育15 min后用流式細胞儀進行檢測。

1.6 統計學方法 采用SPSS 19.0 軟件統計分析。計量資料采用均數±標準差(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SP對K562腫瘤細胞凋亡的影響 與PBS空白對照組相比較，不同濃度組SP作用于K562細胞36 h 后細胞凋亡率均有不同程度的增加，其中50 μg/mL和100 μg/mL濃度組的差異有統計學意義(P＜0.05)；不同濃度組的凋亡情況存在良好的劑量相關性：以SP濃度為縱坐標，K562細胞凋亡率為橫坐標，回歸直線方程的r值為99%。結果表明SP能有效誘導K562細胞凋亡，見表1、圖1。

圖1 細胞凋亡圖

表1 SP對K562細胞腫瘤凋亡的影響(±s)

表1 SP對K562細胞腫瘤凋亡的影響(±s)

注：與PBS空白對照組比較，*P＜0.05。

組別 凋亡率(%)PBS空白對照組 1.01±0.15 SP給藥組5 μg/mL 25 μg/mL 2.36±0.72 4.04±0.29 50 μg/mL 10.92±0.21*100 μg/mL 24.73±0.38*

3 討論

卷柏屬植物作為民間傳統草藥被用于腫瘤方面的治療，其中卷柏屬植物中的墊狀卷柏被中國藥典收錄，主治經閉痛經，跌打損傷等癥，其成分較為復雜，主要有雙黃酮類、炔酚類、苯丙素類、生物堿類等[4-5]。

本課題組前期對SP在不同系列腫瘤細胞系的增生活性進行篩選，發現對人白血病細胞系的敏感性最高，因此在筆者選取對SP敏感性最高的K562腫瘤細胞進行進一步研究，發現能有效誘導腫瘤細胞的凋亡。近年來有文獻報道[1-2，6-10]，SP能通過誘導細胞凋亡而產生抑制腫瘤增生作用的，其機制可能是Caspase途徑的激活從而導致Bcl-2表達減弱有一定關系，有研究表明[11-15]SP對Bax mRNA表達有明顯上調作用，Bcl-2 mRNA表達存在明顯下調作用，從而抑制Bcl-2表達，且有劑量依賴性，進而誘導細胞的凋亡。本研究也證實SP抗腫瘤活性的可能機制是促進細胞凋亡，但具體分子生物學機制仍需進一步的研究和探討。

綜上所述，SP通過誘導K562腫瘤細胞凋亡，從而實現其抗腫瘤的目的。