基于網絡藥理學探討小青龍湯治療慢性腎小球腎炎的潛在作用機制

鄭爽 何麗清 儲開博

山西中醫藥大學 山西，晉中 030619

小青龍湯是《傷寒論》中治療外寒里飲的經典方劑，臨床多用于治療肺系疾病[1]。除此之外，小青龍湯在臨床上也可治療與肺、脾、腎三臟相關的水液代謝疾病，例如痰飲、水腫、泄瀉等[2]，也有醫家運用小青龍湯治療慢性腎臟疾病的相關案例[3-4]。

慢性腎小球腎炎（chronic glomerulonephritis，CGN），簡稱慢性腎炎，是臨床常見的慢性腎臟病，以蛋白尿、血尿、水腫等為基本癥狀[5]，具有起病隱匿、病程遷延的特點，現代醫學尚無有效方法根治。CGN在中醫沒有專門的病名，根據臨床癥狀的不同，可將其歸為“尿血”“水腫”“痰飲”等范疇，中藥治療歷史悠久，而且效果顯著。

網絡藥理學這一概念由英國藥理學家Andrew于2007年提出，是基于系統生物學理論，通過網絡分析技術分析藥物、基因、疾病之間的復雜關系。在臨床上面對復雜疾病時，從網絡生物學角度審視藥物的作用能夠為尋找治療方法提供新的視角[6]。

通過文獻查閱，筆者了解到目前對于小青龍湯的研究多集中于肺系疾病，有少部分文獻報道小青龍湯對CGN具有治療作用，但相關的臨床以及實驗研究均較少，其藥理作用與作用機制尚未明確。本文旨在通過網絡藥理學分析，從分子水平上闡明小青龍湯的化合物成分靶點與CGN的疾病靶點之間的潛在關系，預測小青龍湯治療CGN的潛在作用靶點，為進一步深入研究小青龍湯治療CGN的作用機制提供理論基礎。

1 對象和方法

1.1 小青龍湯化學成分與靶點的收集 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP） （https://tcmspw.com/tcmsp.php），分別以“麻黃、桂枝、芍藥、干姜、細辛、半夏、五味子、甘草”為關鍵詞，檢索小青龍湯組方中藥物的化學成分。以藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為篩選條件進行篩選，得到小青龍湯的候選化合物以及這些成分所作用的靶點，重復靶點僅保留1個。

1.2 小青龍湯治療CGN的潛在靶點的獲取 以“chronic glomerulonephritis”為檢索詞，分別從在線人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數據庫、基因組注釋數據平臺（genome annotation database platform，Genecard）中搜索已報道的CGN的相關基因，去除重復基因和假陽性基因，將收集到的基因與上述成分靶點上傳至韋恩圖2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）進行匹配分析，得到小青龍湯治療CGN相關的潛在作用靶點。

1.3 預測潛在核心成分以及核心靶點 將小青龍湯治療CGN的潛在作用成分與靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件構建“化合物-靶點”網絡圖。通過軟件分析節點自由度（Degree），對各節點進行拓撲分析，篩選出小青龍湯治療CGN的核心成分與核心靶點。

1.4 蛋白質相互作用（protein protein interaction，PPI）網絡圖的構建 將小青龍湯的核心作用靶點上傳至String 11.0平臺（https://string-db.org）得到核心靶點的PPI網絡，并構建PPI網絡圖。

1.5 潛在作用靶點的通路富集分析 將小青龍湯治療CGN的潛在作用靶點上傳至生物學信息注釋數據庫DAVID（https://david.ncifcrf.gov/），進行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析，GO分析包括生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）。 以P＜0.01為篩選條件篩選GO條目，以P＜0.05為條件篩選KEGG條目，最后將GO和KEGG富集分析結果進行可視化。

2 結果

2.1 小青龍湯藥物化合物和靶點的篩選 在TCMSP中檢索小青龍湯中8味中藥的化合物及其對應的作用靶點，得到1 534種化合物，以OB≥30%、DL≥0.18篩選后去掉重復化學成分，得到小青龍湯的有效化合物149種，作用靶點288個。

2.2 小青龍湯治療CGN潛在靶點的獲取 通過數據庫檢索，得到CGN相關基因共有2 425個。通過與小青龍湯的288個作用靶點進行比對，篩選出154個可能與治療CGN相關的作用靶點。見圖1。

圖1 小青龍湯與CGN靶點的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Xiaoqinglong Decoction and CGN

2.3 預測潛在核心成分以及核心靶點 通過Cytoscape 3.7.2軟件構建“化合物-靶點”網絡。見圖2。圖中菱形節點代表小青龍湯治療CGN的核心化合物，圓形節點代表小青龍湯治療CGN的核心靶點，顏色深淺表示Degree大小，顏色越深則Degree值越大。以化合物和靶點為節點（Node），相互關系為邊（Edge），利用軟件分析各個節點的自由度（Degree）進行網絡拓撲分析，預測小青龍湯治療CGN的核心成分與核心靶點，共篩選出40個潛在核心成分和40個潛在核心靶點。部分信息見表1。

表1 部分小青龍湯治療CGN核心化合物及其所對應的核心靶點Tab.1 Some core components and related targets of Xiaoqinglong Decoction Treating CGN

圖2 小青龍湯治療CGN的“化合物-靶點”網絡圖Fig.2 The component-target network diagram of Xiaoqinglong Decoction and CGN

2.4 PPI網絡圖的構建 將小青龍湯治療CGN的核心靶點導入String 11.0平臺，在線構建PPI網絡圖。見圖3。網絡中有40個節點發生相互作用，相互作用的邊有155條，平均自由度（Degree）為7.75。

圖3 PPI網絡圖Fig.3 PPI network diagram

2.5 潛在靶點的GO、KEGG富集分析 將小青龍湯治療CGN的潛在核心靶點導入生物學信息注釋數據庫DAVID 6.7在線進行GO富集分析，共獲得GO條目279條，其中BP 275條、CC 31條、MF 46條。 以P＜0.01為條件進行篩選，對前10項進行可視化。見圖4。小青龍湯治療CGN涉及血管生成、血管內皮細胞遷移的正調控、脂多糖介導的信號通路、類固醇激素受體活性、細胞外調節蛋白激酶1（extracellular regulated protein kinases 1，ERK1）和ERK2級聯的正調控等過程。

圖4 GO功能分析可視化結果Fig.4 Visualization result of GO

將小青龍湯治療CGN的潛在核心靶點導入DAVID 6.7進行KEGG通路富集分析，得到KEGG通路條目89條，以P＜0.05為條件，對前25條通路進行可視化分析。見圖5。KEGG通路富集分析結果中包括血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路、缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶 B （phosphatidylinositide 3-kinases-protein kinase B，PI3K-Akt）信號通路和Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）信號通路等，說明小青龍湯治療CGN的機制可能與調節這些信號通路相關。

圖5 KEGG通路富集分析可視化結果Fig.5 Visualization result of KEGG pathway

3 討論

中醫認為CGN的病位主要在肺脾腎三臟。脾主運化，脾氣虧虛，則不能運化水濕；腎主水，腎氣虧虛，則不能氣化水濕、宣通水氣。根據五行生克的原理，肺屬金能生水，為腎水之母，子病治母是中醫的治法之一；且肺主氣行治節，明代張介賓[7]認為，水腫“蓋水為至陰，故其本在腎；水化于氣，故其標在肺”。肺主宣發肅降，能夠肅降水液，下輸至腎與膀胱，肺失宣降導致氣機不調，精微不升，出現蛋白尿和尿血等癥狀。CGN在中醫屬“尿血”“水腫”“痰飲”等范疇，《金匱要略》中提出“痰飲”“水腫”可通過發汗、利尿等方法治療。小青龍湯主治外寒里飲證，以麻黃、桂枝為君，發

汗散寒解表、溫陽化氣，以化腎水；細辛、干姜為臣，助麻桂解表的同時亦能溫腎行水；白芍五味子味酸收斂，以免辛散肺氣太過，亦為臣；半夏為使，降氣散水飲；甘草為佐使，益氣和中、調和諸藥。故CGN辨證外寒里飲兼有水腫時，可用小青龍湯治療。從現代醫學角度分析，CGN合并感染，誘發機體免疫反應，日久造成腎損傷，引發或加重CGN[8]。根據文獻報道，小青龍湯治療CGN寒飲蘊肺證大鼠，能夠降低大鼠尿蛋白水平，保護腎功能，防止腎組織病理變化，故小青龍湯治療CGN有充足的理論依據[9]。

網絡藥理學是一種通過綜合分析和篩選各種基因、蛋白、藥物數據庫，利用網絡分析軟件構建“化合物-靶點-疾病”網絡，系統揭示三者之間關聯的藥理研究方法[10]。中藥治療CGN所具有的整體性、多靶點、多通路的特點，適合應用網絡藥理學方法進行研究，因此本研究基于網絡藥理學，探討了小青龍湯治療CGN的潛在作用機制。

本研究通過構建“化合物-靶點”網絡圖，找到了小青龍湯治療CGN的潛在核心化合物，這些化合物均能作用于多個靶點，包括槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、 豆甾醇 （stigmasterol）、β-谷甾醇 （βsitosterol）、柚皮素（naringenin）、木犀草素（luteolin）、黃芩苷（baicalein）、卡維丁（Cavidine）、隱品堿（cryptopin）、花旗松素（taxifolin）等。其中β-谷甾醇為麻黃、桂枝、白芍、干姜、半夏的活性成分，山奈酚在麻黃、白芍、細辛、甘草中均有分布，豆甾醇在麻黃、半夏中分布，兒茶素在麻黃、桂枝、白芍中分布，花旗松素為麻黃、桂枝的活性成分，可以看出君藥麻黃、桂枝中含有多種相同的化合物，由此筆者認為麻黃、桂枝解表散寒、溫化陽氣的功效可能與這些化合物有關。槲皮素是一種黃酮醇類化合物，其作用機制可能是通過抑制表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）磷酸化激活過程，進而抑制其下游蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（protein kinase B/mammalian target of rapamycin，AKT/mTOR）通路的信號傳導，同時抑制該通路下游的增殖相關基因VEGF[11]。實驗研究表明，槲皮素能夠減輕高糖條件下人腎小球內皮細胞的損傷[12]，也能夠減輕放射性對比劑引起的腎損傷，起到保護腎臟的作用[13]。山奈酚也被證實能夠抑制人腎小球內皮細胞氧化應激和凋亡[14]。β-谷甾醇可能通過誘導轉錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1） 和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB） 失活，從而發揮抗炎作用[15]。柚皮素則通過抑制半胱天冬酶-3（caspase-3，CASP3）等凋亡相關蛋白的表達，抑制腎小球系膜細胞凋亡[16]。木犀草素能夠減輕單側輸尿管梗阻大鼠腎臟的炎癥反應，改善腎功能[17]。黃芩苷可能通過調控TLR2/4信號通路和線粒體應激，抑制促炎反應和線粒體介導的細胞凋亡，從而減輕腎臟缺血再灌注造成的損傷[18]。綜合分析提示，小青龍湯通過各組成藥物之間的協同作用，多靶點而并非單一靶點治療CGN，其核心成分能夠通過調節相關通路，從而減輕腎臟炎癥反應，抑制內皮細胞氧化應激和細胞凋亡，緩解腎損傷。

通過分析PPI網絡以及“化合物-靶點”網絡圖，進一步確定了40個核心靶點，包括前列腺素G/H合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、CASP3、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogenactivated protein kinase 14，MAPK14）。 PTGS2也被稱為環氧合酶2（cyclooxygenase，COX-2）。 研究證實，COX-2是前列腺素合成的關鍵誘導酶，參與炎癥反應、血管緊張度維持、電解質平衡和腎素釋放過程，且與蛋白尿誘導的足細胞損傷有關[19]。Yang等[20]研究證實，CASP3能夠對腎纖維化以及微血管內皮細胞凋亡起到調節作用。腎小球系膜細胞的增殖失控是腎臟疾病的共同特征，ESR1作為樞紐蛋白在腎小球膜細胞增殖中具有重要作用，目前被認為是腎臟疾病的潛在靶標之一[21]。AR在許多細胞和組織中廣泛表達，研究表明AR可能通過調節血管內皮生長因子/缺氧誘導轉錄因子-2α（vascular endothelial growth factor/hypoxia-inducible transcription factor-2α，VEGF/HIF-2α）信號通路的信號傳導來促進腎癌細胞遷移[22]。MAPK14參與多種信號通路的過程，與細胞增殖分化以及炎癥反應密切相關。研究表明，MAPK14在腎小管細胞炎癥和增殖反應的調節中具有重要作用，通過促進炎癥和細胞死亡，導致急性腎損傷[23]。

GO及KEGG富集分析結果顯示，小青龍湯治療CGN主要涉及血管生成、血管內皮細胞遷移的正調控、脂多糖介導的信號通路、類固醇激素受體活性、細胞外調節蛋白激酶的正調控等過程，參與調控的信號通路包括VEGF信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路和TLR信號通路，表明小青龍湯的多種活性化合物通過參與調控多種信號通路，協同發揮療效。VEGF信號通路通過抑制足細胞中VEGF和Nephrin蛋白的表達，造成蛋白尿[24]。抑制HIF-1信號通路能夠改善腎間質纖維化大鼠腎功能，緩解腎組織腎小球硬化[25]。TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路則能夠通過調節細胞周期，抑制細胞凋亡和炎癥反應[26]。

綜上所述，本次研究基于網絡藥理學網絡化、可視化的特征，初步研究小青龍湯治療CGN潛在的作用機制，找到了其治療機制中的核心化合物與核心靶點，分析了相關生物過程和信號通路，但網絡藥理學是基于數據庫的綜合分析和篩選，并未進行實際的實驗研究，故本研究的結論仍需要進一步的體外和體內研究加以證明。