磷霉素殼寡糖鹽的合成與抗菌活性測試

李 爽，李 麗，姜志煒，金學平，余 磊，傅曦卉，王艷武，李 雪，祝 宏*

1.武漢工程大學化工與制藥學院，環境生態與生物工程學院，湖北 武漢430205；2.武漢市藥物增溶工程技術研究中心，湖北 武漢430205；3.武漢軟件工程職業學院，湖北 武漢430205

磷霉素是一種從混合鏈霉菌發酵液中獲取的天然廣譜抗生素，由美國MERCK公司和西班牙CEP公司發現［1］。磷霉素對大腸桿菌、葡萄球菌屬、沙雷菌屬、志賀菌屬等有較強的抑制效果。肽聚糖是細菌合成細胞壁時不可或缺的成分之一，磷霉素與磷酸烯醇丙酮酸結構近似，可以競爭性地與丙酮酸-二磷酸尿嘧啶-乙酰葡糖胺轉移酶進行不可逆結合，使得二磷酸尿嘧啶-N-乙酰葡糖胺丙酮酸鹽的合成受到阻礙，導致細菌自身無法產生肽聚糖，破壞細菌細胞壁的合成，繼而達到抗菌目的［2-4］。殼寡糖是由殼聚糖降解得到的產物，聚合度在2到20之間［5-6］，因其有游離的氨基而呈弱堿性，對多種細菌有抑制作用。同時，生物相容性也是殼寡糖具有的優勢之一［7-8］。磷霉素中作為藥效團的環氧環不穩定，常以鹽的形式存在從而獲得較高的穩定性［9］，因而可以利用拼合原理將兩種藥物拼合在一起，得到的新結構可以改變原有藥物的藥代動力學，有利于增加藥物的穩定性、減少細菌耐藥性的產生、降低原有藥物的毒副作用［10-12］。根據上述藥物拼合理論，本文合成了磷霉素殼寡糖鹽，合成路線如圖1所示。

圖1 磷霉素殼寡糖鹽的合成路線Fig.1 Synthesis route of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，ZF7三用紫外分析儀，旋轉蒸發器RE-52C，低溫恒溫反應浴DFY-5L/40（鞏義市予華儀器有限責任公司）；AB204-N型電子天平（南京安鐸貿易有限公司）；SCIENTZ-10N冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；GS-2電熱鼓風干燥箱（上海實驗儀器總廠）；Perkin Elmer傅立葉紅外光譜儀（PerkinElmer股份有限公司）；Mercury Plus 400型核磁共振儀（美國Varian公司）。

1.1.2 試劑 殼寡糖（浙江金殼藥業股份有限公司，純度＞90%，脫乙酰度＞70%），磷霉素（R）-1-苯乙 胺 鹽［實 驗 室 自 制 ，phosphonomycin（R）-1-phenethylaminesalt，PF］，大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂（國藥集團化學試劑有限公司），氯型717強堿性陰離子交換樹脂（國藥集團化學試劑有限公司），其余反應中用到的試劑規格均為分析純。

1.2 實驗內容

1.2.1 中間體Ⅰ-磷霉素酸的制備 大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂的預處理：將樹脂于蒸餾水中浸泡2～3 d，充分活化樹脂。取200 mL質量分數（下同）5%的鹽酸在攪拌下交換4～5 h，樹脂轉化為H型后棄去酸液，蒸餾水洗滌樹脂到中性；再用適量質量分數5%的氫氧化鈉溶液交換4～5 h，轉化成Na型后棄去堿液，蒸餾水洗滌樹脂到中性；最后再用300 mL質量分數5%的鹽酸進行第3次的交換，蒸餾水洗滌樹脂到中性備用。

磷霉素鈉的制備：稱取0.578 g（14.450 mmol）氫氧化鈉，加5 mL蒸餾水溶解于燒瓶中，室溫條件下攪拌10 min制得氫氧化鈉溶液；加熱到37℃，緩慢地加入2.200 g（8.486 mmol）PF，在攪拌下充分反應1 h后分液，靜置2 h，待分層完全后，收集下層的磷霉素鈉水溶液。

中間體Ⅰ磷霉素酸的制備：取已經活化完畢的大孔強酸性苯乙烯系樹脂50 mL于250 mL的三口燒瓶，加少量無水乙醇，全程攪拌，預冷至?10℃，加入上一步制得的磷霉素鈉水溶液，交換15 min，在此溫度下從燒瓶中抽濾出液體；再用50 mL預冷的無水乙醇重復2次洗滌樹脂，收集洗滌液和抽濾液即為中間體磷霉素酸水溶液。

1.2.2 殼寡糖的預處理 氯型717強堿性陰離子交換樹脂的預處理：將樹脂于蒸餾水中浸泡2～3 d，充分活化樹脂。取200 mL質量分數5%的氫氧化鈉在攪拌下交換4～5 h后，蒸餾水洗滌樹脂到中性；再用適量質量分數5%的鹽酸交換4～5 h后，蒸餾水洗滌樹脂到中性；最后再用300 mL質量分數5%的氫氧化鈉溶液進行第3次交換，蒸餾水洗滌樹脂到中性備用。

游離殼寡糖的制備：稱取6.600 g殼寡糖，用25 mL蒸餾水溶于燒杯，攪拌溶解；量取預處理后的氯型717強堿性陰離子交換樹脂100 mL，室溫攪拌的條件下交換15 min，抽濾；用150 mL蒸餾水分次洗滌，合并抽濾液和洗滌液即為殼寡糖溶液。

1.2.3 目標產物Ⅱ-磷霉素殼寡糖鹽的合成 上述步驟制得的磷霉素酸溶液與殼寡糖溶液合并，室溫條件下攪拌、反應30 min；55℃下減壓蒸餾除去乙醇和部分水，液氮預冷后經過冷凍干燥得到6.014 g磷霉素殼寡糖鹽固體粉末。

2 生物活性測試

采用濾紙片法，通過測定抑菌圈的大小比較磷霉素殼寡糖鹽的抗菌活性，選取的4種菌株分別為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌。按照10.000 g蛋白胨、3.000 g牛肉膏、5.000 g氯化鈉、20.000 g瓊脂溶于500 mL蒸餾水的比例，加熱攪拌制得原液；于250 mL三角瓶中分別加入200 mL原液，用棉塞將瓶口塞住，高壓滅菌鍋中121～126℃，0.1 MPa的條件下持續滅菌30 min；移取10 mL于培養皿中，觸晃，均勻地把液體平鋪在培養皿，靜置冷卻待其凝固，制得固體培養基。

磷霉素單獨存在的情況下其活性基團環氧基不穩定，易失去活性；PF為磷霉素鹽類合成中間體不能直接臨床使用，所以選擇磷霉素鈣作為磷霉素端測試樣品與磷霉素殼寡糖鹽進行對比。將5組磷霉素殼寡糖鹽、殼寡糖、磷霉素鈣分別配制成2 mg/mL的無菌藥液，無菌條件下保存。

超凈工作臺滅菌30 min，分別用移液槍量取4種菌株的菌懸液各200μL于固體培養基，每種菌株分別接種于5個培養基，用三角棒涂布器將菌液均勻涂抹后靜置；將2個直徑6 mm厚度1 mm的無菌紙片貼入1個固體培養基，標記；分別用移液槍吸取20μL配置的無菌藥液并注入濾紙片上，用封口膜封閉培養基口，置于恒溫培養箱中37℃下培養16 h，觀察并測量產生的抑菌圈的直徑，同一樣品做3個重復樣。

3 結果與討論

3.1 制備工藝的初步優化

將磷霉素殼寡糖鹽對細菌生長的抑制作用作為評價指標，采用3因素5水平的均勻設計試驗，以PF與殼寡糖的質量比、反應溫度、反應時間作為影響因素，篩選出效果較優的反應條件。按照U（553）因素水平表進行試驗。因素水平表見表1，均勻設計試驗安排表見表2。

表1 均勻試驗設計因素水平表Tab.1 Factor level in uniform design of tests

表2 U（ 553）均勻試驗設計表Tab.2 Uniform design of tests on U（553）

3.2 初步均勻設計及生物活性的測試結果

以未添加任何藥物溶液的空白紙片培養基作為對照組，相同條件下進行細菌的培養，記錄抑菌圈直徑。抑菌圈的直徑大小反映了藥物對細菌生長的抑制作用，抑菌圈的直徑越大就意味著藥物對細菌的抑制效果越好；反之越差。其中加入殼寡糖的培養基未產生抑菌圈，因此可以認為在此含量的基礎上單獨使用殼寡糖沒有抑菌效果［13］；記磷霉素鈣實驗組為第6組，磷霉素殼寡糖鹽、磷霉素鈣對上述4種細菌的抑菌圈實驗結果見表3。

根據抑菌圈實驗的結果可知，3號藥物對大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌的抑制效果最佳，抑制金黃色葡萄球菌的效果中等；結合第6組結果可以知道，對于大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌，磷霉素殼寡糖鹽的抗菌活性與磷霉素鈣的抗菌活性相當；對于金黃色葡萄球菌，磷霉素殼寡糖鹽有一定的活性，但磷霉素鈣活性更優。

以抑菌圈的直徑為指標，在考慮到抗菌范圍、反應條件和成本因素，初步確定磷霉素殼寡糖鹽的最佳制備條件是：PF與殼寡糖的質量比為1∶3，反應溫度為25℃，反應時間為0.50 h。

3.3 譜圖分析

殼寡糖是一個多聚體，且脫乙酰度很難達到100%，所以磷霉素和殼寡糖成鹽的方式眾多，無法獲得單一結構的鹽，因而只能獲得以不同方式連接的鹽的混合物，但是可以利用紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）、氫核磁共振（hydrogen nuclear magnetic resonance，H1-NMR）對其進行表征，驗證活性基團是否存在。

3.3.1 IR 結合磷霉素鈣、殼寡糖的紅外譜圖進行分析，可以看出3 420.93 cm?1處的吸收峰是締合羥基的伸縮振動吸收峰；N?H的伸縮振動吸收峰寬且與羥基峰重疊，比較圖2和圖3中N?H鍵吸收峰較弱，其中2 923.14 cm?1處為伯胺成銨鹽形成的吸收峰；578.96 cm?1與1 636.53 cm?1處也是為氨基的特征峰；圖3中顯示殼寡糖中含有少量未脫去的乙酰基，所以1 636.53 cm?1處也有少量羰基的吸收峰與之重疊；1 071.60 cm?1處是醚鍵伸縮振動而產生的吸收峰。

圖2 紅外光譜圖：（a）磷霉素鈣，（b）殼寡糖，（c）磷霉素殼寡糖鹽Fig.2 IRspectra：（a）fosfomycin calcium，（b）chitosan oligosaccharide，（c）fosfomycin chitosan oligosaccharide salt

3.3.2 H1-NMR 從圖3可知，化學位移值在1.0處的吸收峰為環氧基上甲基上C?H的吸收峰；化學位移值在3.0到4.0的多重峰為殼寡糖上與氧原子相連C?H的吸收峰和與環氧基上C?H的吸收峰；吸收強度最大的為溶劑重水上氫的吸收峰，化學位移值為4.8，一些活性官能團上的氫原子與重水上的氘原子進行交換，信號消失，如羥基、氨基。

圖3 磷霉素殼寡糖鹽的核磁共振氫譜Fig.3 1H-NMRspectrum of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt

4 結 論

雖然磷霉素于20世紀40年代就被發現有抗菌作用，但至今仍在對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌乃至部分耐藥菌株的實驗中表現出不錯的活性，在超級細菌事件頻出的現在具有較好的研究價值［14-15］。本研究根據拼合原理將磷霉素和殼寡糖結合在一起，采用抑菌圈法驗證了磷霉素殼寡糖鹽的抗菌活性并與單用磷霉素鈣、殼寡糖進行了對比，驗證出新型磷霉素殼寡糖鹽與磷霉素鈣具有相似的活性，達到了豐富磷霉素抗菌藥物種類的實驗目的；初步確定了反應的最佳條件為PF與殼寡糖的質量比為1∶3，成鹽反應的溫度為25℃，反應時間為0.50 h。此外，本反應條件溫和、環境友好、成本低廉，易于實現工業化的生產。