老年糖尿病腎病患者血清SP-D水平表達及其基因多態性與并發肺部感染的相關性研究

閆海燕，楊云秀，楊云華，宋曉偉，緱 劍

（1.咸陽市第一人民醫院呼吸與危重癥醫學科 陜西咸陽 712000；2.陜西唐華四棉醫院呼吸科，西安 710038；3.西安北車醫院內科，西安 710085）

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是因糖尿病進展累及腎臟微血管引起的腎小球硬化癥，DN 也成為終末期腎病的主要原因[1]。目前認為，肺部感染是DN 常見并發癥。糖脂代謝紊亂是DN 的重要機制，DN 患者長期處于高血糖狀態，自身免疫防御能力降低，尤其是老年患者，全身機體功能衰退，更易發生肺部感染[2-3]。而肺部感染可進一步加重腎損傷。因而，長期以來，肺部感染一直是老年DN 患者防治重點。表面活性蛋白D(surfactant protein D，SP-D)是由Ⅱ型肺泡細胞和呼吸性細支氣管clara 細胞分泌的蛋白，既往研究證實SP-D 與慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)發病和病理進展密切相關，SP-D 與肺功能水平具有顯著相關性[4-5]。但有關SP-D 與DN 患者并發肺部感染的關系，國內卻少有報道。本研究納入108 例老年DN患者作為研究對象，探討SP-D 在DN 并發肺部感染中的作用和臨床應用價值。報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年4月～2020年10月咸陽市第一人民醫院108 例老年DN 患者作為研究對象，納入標準：①DN 診斷參照中華醫學會內分泌學會推薦共識標準[6]；②患者臨床病例資料完整。排除標準：①并發原發性腎小球腎炎、腎盂腎炎及腎病綜合征患者；②并發有惡性腫瘤者；③并發有肺結核、支氣管炎及肺間質性疾病者。根據是否并發肺部感染，將108 例DN 患者分為感染組(n=26，并發肺部感染)和對照組(n=82，未并發肺部感染)。感染組26 例患者中男性17 例，女性9例；年齡70.21±4.75 歲；體重指數20.29±1.81kg/m2；病程3.58±1.09年。對照組82 例患者中男性64 例，女性18 例；年齡69.53±4.47 歲；體重指數20.34±2.01kg/m2；病程3.60±0.84年。兩組患者基本資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。根據肺炎嚴重指數(pneumonia severity index，PSI)評分[7]，將感染患者分為輕度組(PSI 評分<91 分)，中度組(91≤PSI評分≤130分)及重度組(PSI評分>130分)。

1.2 儀器和試劑 博科BIOBASE TGL-18M 型離心機，ELISA 試劑盒(上海賽默科技生物發展有限公司)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)(上海純優生物科技有限公司)，細胞裂解液(南京信帆生物技術有限公司)，蛋白酶K(洛陽惠爾納米科技有限公司)，酚氯仿異戊醇、醋酸鈉(北京普博欣生物科技有限責任公司)。

1.3 方法 血清SP-D 檢測：在DN 確診后3 天內取108 例患者清晨空腹肘靜脈血5ml，3 000r/min 離心10min后取上清液，采用ELISA法檢測血清SP-D水平。

DNA 提取：取確診后3 天內空腹肘靜脈血3ml作為檢測標本，將靜脈血置于含有EDTA 的抗凝管中，冷凍備用。提取DNA 步驟：①先將標本解凍，以等量PBS 與之混勻，3 000r/min 離心10min，棄上清液，加入細胞裂解液300μl，混勻后37℃下水浴60min，再依次加入20g/dl 的SDS 液25μl 和蛋白酶K 20μl，水浴過夜。②取水浴后的細胞液，按3:1比例與酚氯仿異戊醇混勻，離心后取上清液，再次重復上述操作1 次。③取上清液400μl，再加入無水乙醇和醋酸鈉800μl 和15μl，沉淀DNA，再以8 000r/min 離心，棄上清液。④以70ml/dl 乙醇洗滌沉淀，再加入Tris-EDTA 液20μl，溶解后冷凍保存。

PCR-RFLP 檢測：采用PCR-RFLP 法檢測SP-D基因多態性，記錄SP-D 基因Metll Thr (rs721917 T/C)位點頻率分布情況，PCR 擴增條件：PCR 擴增引物：上游：5’-TCACCTCTCAGGCCATGCTGCTCTT CCTCC-3’，下游：5’-GAGCTACACATGACCAG GGTGCAAGCACTG-3’。反應體系：15μl 2×PCR PLUS MIX，1.5μl DNA 模板，上下游引物各0.5μl，10×PCR 緩沖液2.5μl。反應條件：95 ℃預變性5min，94℃ 變性0.5min，58℃退火 1min，72℃延遲0.5min，40 個循環。72℃延遲5min。

1.4 統計學分析 選用SPSS 24.0 軟件對數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間行t檢驗，計數資料以[n(%)]表示，組間行χ2檢驗，預測價值采用受試者工作曲線(receiver operator characteristic，ROC)分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組SP-D 和基因位點分布 感染組血清SP-D水平為24.18±5.39ng/L，對照組血清SP-D 水平為20.02±4.54ng/L，兩組間差異有統計學意義（t=3.888，P<0.001）。SP-D 基因型位點率分布差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組基因位點分布[n(%)]

2.2 不同肺炎程度患者SP-D 水平比較 26 例肺部感染患者中輕度14 例，中度8 例，重度4 例。輕度組患者血清SP-D 為 17.24±3.77 ng/L，中度組23.17±3.82 ng/L，重度組25.29±2.18 ng/L。三組患者血清SP-D水平比較，差異有統計學意義(F=11.325，P<0.001)。

2.3 不同肺炎程度患者SP-D基因多態性分布 見表2。不同程度肺部感染患者SP-D基因型頻率分布比較，差異有統計學意義（χ2=4.288，P<0.001)。

表2 不同肺炎程度患者SP-D 基因多態性分布

2.4 SP-D 判斷DN 伴發肺部感染的價值分析 見圖1。ROC 分析顯示血清SP-D 判斷DN 并發肺部感染的AUC 為0.779(SE=0.056，95%CI=0.669～0.890，P=0.000)，敏感度為0.769，特異度為0.598。

圖1 SP-D 判斷DN 伴發肺部感染的ROC 分析

3 討論

DN 伴發肺部感染的病理機制較為復雜。長期的高血糖不僅可形成酸性環境，直接破壞機體抵抗力，還可導致和加重肺組織缺氧，增加肺部感染的易感性[8]。另外，隨著DN 患者體液免疫失調，白細胞粘附作用減弱，為致病菌的滋生繁殖創造了條件[9]。SP-D 是具有維持肺泡表面活性物質穩定和保護肺組織局部免疫功能的親水性蛋白，基礎實驗顯示SP-D對中性粒細胞、單核-巨噬細胞具有趨化作用，還可通過抑制炎性因子合成，緩解肺部炎癥，而對于肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌等肺部常見病原菌，則具有與IgG 相近的作用，增強吞噬細胞活性，促進病原菌的吞噬[10-12]。本研究對比DN 并發肺部感染與未感染者血清SP-D 水平，也發現兩組間血清SP-D 差異有統計學意義，提示監測SP-D 有助于判斷肺部感染風險。而ROC 分析顯示血清SP-D 判斷DN 并發肺部感染的AUC 為0.779，這進一步證實SP-D 水平對預測肺部感染具有一定應用價值，但血清SP-D 敏感度和特異度均有限。這可能與SP-D 基因多態性有關。

SP-D基因多態性與肺疾病的關系已被臨床報道。SP-D Metll Thr（rs721917 T/C）的多態性是目前臨床關注較多的SP-D 基因，徐麗等[13]認為rs721917 等位基因與間質性肺炎相關，而ISHII 等[14]的一項研究發現rs721917C 可能增加COPD 易感性。rs721917位點不同基因型表達可影響其正常結構和功能[15]，本研究發現感染組與對照組rs721917 位點基因型分布差異有統計學意義，提示SP-D 基因rs721719 位點多態性與DN 患者并發肺部感染的易感性有關。對于血清SP-D 升高的CC 基因型DN 患者，并發肺部感染的機率更高。另外，本研究還發現不同肺炎程度患者血清SP-D 及其基因型表達也存在顯著性差異，提示SP-D 可能參與肺部感染的病理進展。隨著肺部感染的發生發展，肺泡毛細血管屏障功能受損，使SP-D 進入血液循環，進而使血清SP-D 水平升高[16]。因而，血清SP-D 可作為判斷肺部感染嚴重程度的判斷依據。而對于rs721917 位點CC 基因型患者，較其他位點，肺功能損傷程度更重[17]。本研究也顯示CC 基因型肺部感染病情更為嚴重，與上述報道結果一致。

綜上，血清SP-D 水平有助于判斷DN 并發肺部感染風險，CC 基因型患者較其他基因型患者更易發生肺部感染，且病情較重。