腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型建立方法及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展

★ 李威 王順譜 楊鳳云（.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 南昌 330004；.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006）

腎陽(yáng)虛是指腎陽(yáng)氣虧虛，溫煦功能下降而導(dǎo)致的腰膝酸軟、畏寒肢冷、精神不振、舌淡胖苔白、脈沉弱無(wú)力為主要表現(xiàn)的證候。鄺安堃［1］等開(kāi)創(chuàng)了動(dòng)物腎陽(yáng)虛模型的先河，模擬了最原始的腎陽(yáng)虛模型，首次將中醫(yī)學(xué)證型與現(xiàn)當(dāng)代實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行結(jié)合，隨著后續(xù)研究的深入，常用的造模方法也逐漸增多，與此同時(shí)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)也不斷改進(jìn)，造模方法主要包括中醫(yī)傳統(tǒng)病因造模、藥物造模及手術(shù)造模法，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)包括中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)和生化標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)對(duì)目前情況作如下綜述。

1 造模方法

1.1 中醫(yī)傳統(tǒng)病因造模 主要有三種，見(jiàn)表1。

表1 中醫(yī)傳統(tǒng)病因造模方法

1.1.1 恐傷腎造模 此模型根據(jù)中醫(yī)理論中五行學(xué)說(shuō)，腎主恐，腎臟對(duì)應(yīng)七情當(dāng)中的恐，當(dāng)恐太過(guò)則會(huì)傷及相應(yīng)臟腑。劉宏等［2］通過(guò)讓老鼠觀看貓吃鼠，使老鼠受驚嚇，連續(xù)14d，建立腎陽(yáng)虛模型，馮新玲等［3］使用貓來(lái)恐嚇孕鼠，導(dǎo)致其仔鼠腦發(fā)育不完善，導(dǎo)致仔鼠的腎陽(yáng)虛。

1.1.2 房勞造模 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為房勞過(guò)度會(huì)傷及腎臟，導(dǎo)致腎虛。李震等［4］通過(guò)迫使雄鼠每天與動(dòng)情期雌鼠過(guò)度交配，每天更換不同的雌鼠，同時(shí)每天讓大鼠游泳半個(gè)小時(shí)耗損其體力，連續(xù)一個(gè)月后大鼠出現(xiàn)了腎陽(yáng)虛證型的相關(guān)癥狀。

1.1.3 年老動(dòng)物自然造模 不對(duì)動(dòng)物進(jìn)行干預(yù)，正常飼養(yǎng)，飼養(yǎng)一年以后，密切關(guān)注大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)，當(dāng)出現(xiàn)腎陽(yáng)虛的癥狀體征表示造模成功。姚建平等［5-6］通過(guò)對(duì)正常大鼠飼養(yǎng)15個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)腎陽(yáng)虛造模成功。

中醫(yī)傳統(tǒng)病因造模方法這種造模方法較符合中醫(yī)理論，不會(huì)因?yàn)橥饬Χ鴮?dǎo)致的不確切的影響，但造模效果不夠穩(wěn)定，比較浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)資源，造模時(shí)間偏長(zhǎng)，影響因素較多，公認(rèn)性較低。

1.2 藥物造模 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)腎陽(yáng)虛的發(fā)生主要與下丘腦－垂體－靶腺軸功能的紊亂有關(guān)［7］，主要包括下丘腦－垂體－腎上腺軸（Hypothalamic pituitary gonadal axis，HPA）、下丘腦－垂體－性腺軸（Hypothalamic pituitary gonadal axis，HPG） 和下丘腦－垂體－甲狀腺軸（Hypothalamus pituitary thyroid axis，HPT）三種，而造模也是針對(duì)不同的軸使用相應(yīng)的藥物破壞其正常功能，從而導(dǎo)致腎陽(yáng)虛的發(fā)生。見(jiàn)表2。

表2 藥物造模方法

1.2.1 糖皮質(zhì)類激素造模 糖皮質(zhì)類激素造模中最常用的就是氫化可的松，此類藥主要是作用于HPA，可以抑制垂體分泌促腎上腺激素（ACTH）的分泌，抑制HPA軸，使得腎上腺分泌腎上腺素受抑制，出現(xiàn)近似腎陽(yáng)虛癥狀。茍小軍等［8］以25 μg/（g·d）的量，用氫化可的松肌注大鼠雙側(cè)后肢，持續(xù)15 d，何書(shū)芬等［9-10］同樣用氫化可的松對(duì)大鼠雙側(cè)后肢肌注造模，以15 mg/（kg·d）的量，持續(xù)造模21 d，造模大鼠都會(huì)表現(xiàn)有體重下降、畏縮抱團(tuán)、畏寒肢冷及毛發(fā)稀疏等典型腎陽(yáng)虛的表現(xiàn)，造模明顯成功。此類造模方法是最早使用，也是目前使用率最高的造模方法。

1.2.2 腺嘌呤造模 由于腺嘌呤的過(guò)度攝入導(dǎo)致其過(guò)量的代謝產(chǎn)物會(huì)影響腎臟的功能，此法主要作用于HPG軸，導(dǎo)致功能紊亂，從而形成腎陽(yáng)虛模型。王家輝等［11］通過(guò)給雄性大鼠腺嘌呤灌胃，以200 mg/（100 g·d）的量持續(xù)灌胃28 d，對(duì)大鼠生殖系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其受損嚴(yán)重，且灌胃中期就開(kāi)始出現(xiàn)了腎陽(yáng)虛。腺嘌呤造模也比較常用，僅次于氫化可的松造模。

1.2.3 抗甲狀腺藥物造模 常用的藥物有甲巰咪唑和丙硫氧嘧啶，此類藥物能夠抑制HPT軸，抑制甲狀腺中甲狀腺激素的合成和分泌，導(dǎo)致該軸的紊亂。翟旭峰等［12］以10 mg/（kg·d）劑量的甲巰咪唑給大鼠進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃15d，對(duì)大鼠血清中甲狀腺激素檢測(cè)發(fā)現(xiàn)含量下降，再結(jié)合癥狀表明造模成功。王曉英等［13］使用丙硫氧嘧啶對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，持續(xù)21 d，也可以造出腎陽(yáng)虛模型。

1.2.4 其他藥物造模 除以上常用的藥物造模方法外，還有部分應(yīng)用不太廣泛的藥物造模方法，如羥基脲、卡那霉素、雷公藤多甙及利血平等藥物造模［14-15］，這些藥物不屬于以上三類，但也有其作用的機(jī)制，也可以建立腎陽(yáng)虛模型。

藥物造模方法具有一定的優(yōu)勢(shì)，目前使用率最高，造模時(shí)間短，效果明顯，但藥物造模會(huì)對(duì)造模動(dòng)物產(chǎn)生不同程度的病理?yè)p害，需酌情選擇。

1.3 手術(shù)造模 手術(shù)造模的原理與藥物造模的大同小異，只是造模的方式不同，手術(shù)造模比藥物造模的程度更重，常用的造模方法如下，見(jiàn)表3。

表3 手術(shù)造模方法

1.3.1 去勢(shì)造模 指切除雌性大鼠的卵巢和雄性大鼠的雙側(cè)睪丸，切除了大鼠的性腺會(huì)直接抑制HPG軸，導(dǎo)致雌激素或雄激素的停止分泌，引起該軸的功能紊亂。史宏等［16］切除雄性大鼠的雙側(cè)睪丸進(jìn)行造模，大鼠很快出現(xiàn)腎陽(yáng)虛。肖誠(chéng)等［17］通過(guò)切除大鼠性腺進(jìn)行造模，手術(shù)28 d后，腎陽(yáng)虛模型建立成功。

1.3.2 甲狀腺切除造模 是指切除大鼠的甲狀腺，干擾甲狀腺的分泌，導(dǎo)致HPT軸的功能紊亂，因此建立腎陽(yáng)虛模型。盧德趙等［18］切除大鼠雙側(cè)甲狀腺，術(shù)后正常飼養(yǎng)，7 d后出現(xiàn)畏寒肢冷、活動(dòng)減少、體重減少及大便糖稀等陽(yáng)虛癥狀，造模成功。

1.3.3 腎上腺切除造模 指切除大鼠腎上腺，此種手術(shù)方法較復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的掌握要求更高，腎上腺的摘除會(huì)直接影響HPA軸，導(dǎo)致全身興奮度下降，而體現(xiàn)出典型的腎陽(yáng)虛癥狀。陳小野等［19］通過(guò)把大鼠腎上腺切除，術(shù)后5周對(duì)大鼠相關(guān)器官的病理情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)相關(guān)器官損傷嚴(yán)重，且出現(xiàn)類似腎陽(yáng)虛證型的癥狀。

手術(shù)造模主要就是以上幾種，同時(shí)腎切除加阿霉素造模也有學(xué)者使用過(guò)［20］，目前還處于探索階段，具體效果還需進(jìn)一步深入研究。手術(shù)造模應(yīng)用也較廣泛，造模效果最為明顯，程度最深，但造模過(guò)程較復(fù)雜，需要一定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比較浪費(fèi)。

2 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.1 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 指根據(jù)中醫(yī)診斷學(xué)理論中對(duì)患者腎陽(yáng)虛證型的診斷標(biāo)準(zhǔn)，直接運(yùn)用到造模動(dòng)物上，典型的癥狀體征有畏寒肢冷、體溫下降、體重減輕、抱團(tuán)蜷縮、毛發(fā)稀疏、大便稀溏及小便清長(zhǎng)等［21］。這種評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于動(dòng)物來(lái)說(shuō)不好觀察，容易產(chǎn)生偏差，可行性不高。

2.2 生化指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 應(yīng)用廣泛的生化指標(biāo)主要有兩種，環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）的含量以及兩者的比值的變化常常作為特異性標(biāo)準(zhǔn)［22］，腎陽(yáng)虛時(shí)血清中cAMP含量降低，而cGMP的含量升高，從而兩者的比值隨之降低。另外睪酮（T）與雌二醇（E2）的含量及其比值的變化也可以作為客觀標(biāo)準(zhǔn)［23］，這幾個(gè)指標(biāo)的變化主要與造模動(dòng)物的雌雄有關(guān)，雌性動(dòng)物的腎陽(yáng)虛血清中T含量升高，E2含量降低，T/E2隨之增大，雄性動(dòng)物中T含量降低，E2含量升高，T/E2隨之減小。其他的指標(biāo)如腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）、促腎上腺激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）和皮質(zhì)醇（cortisol，CORT）、三碘甲狀腺原氨酸（thyroxine，T3）及四碘甲狀腺原氨酸（thyroxine，T4）含量的降低也作為腎陽(yáng)虛的客觀指標(biāo)［24］，這些都是用來(lái)檢測(cè)下丘腦－垂體－靶腺軸功能的指標(biāo)［25-27］，通過(guò)指標(biāo)來(lái)反應(yīng)該軸功能的紊亂，剛好與造模原理相呼應(yīng)。

3 討論

腎陽(yáng)虛本僅屬于中醫(yī)疾病中的一個(gè)證型，隨著科研和臨床對(duì)于腎陽(yáng)虛的深入探究，慢慢的腎陽(yáng)虛已經(jīng)和現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合了，已經(jīng)形成了具有科學(xué)意義的造模方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，廣泛被科研人員所采用。其中造模動(dòng)物的選擇一般是大鼠，飼養(yǎng)簡(jiǎn)單，成本較低；造模方法最常用的就是氫化可的松肌注造模，效果明顯，時(shí)間較短而操作簡(jiǎn)單，其次就是腺嘌呤喂養(yǎng)造模；造模的機(jī)理主要是導(dǎo)致下丘腦－垂體－靶腺軸功能的紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致激素水平的降低表現(xiàn)出近似腎陽(yáng)虛的癥狀，方法多種需根據(jù)自身具體情況而選擇，挑選出最符合自身實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平及實(shí)驗(yàn)要求的造模方法；而評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)較統(tǒng)一且固定，主要就是cAMP、cGMP、T及E2等幾個(gè)指標(biāo)的變化，比較公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。

總之，目前造模方法種類雖多，但造模的效果多僅僅只是停留部分器官，依然不能滿足整體性的需要，還需深入探究，或許結(jié)合多種方法的造模方法可以達(dá)到更好的效果；另外評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)依然沒(méi)有一個(gè)客觀量化的標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)服力不強(qiáng)，中醫(yī)腎陽(yáng)虛證型的辨證依據(jù)的癥狀體征對(duì)于動(dòng)物來(lái)說(shuō)可行性不高，建立一個(gè)完整的體系需要臨床和科研人員的不斷努力。