茶菊病毒檢測與脫除技術研究

吳 茜 蔡曉霖 管志勇 朱 波 易 利 鄭永生 鄧邦清 蔣甲福,*

(1 南京農業大學園藝學院/農業農村部景觀設計重點實驗室，江蘇 南京 210095；2 麻城市菊花協會，湖北 麻城 438300)

菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)為菊科菊屬多年生宿根草本植物，原產于中國，栽培歷史已達3 000多年，在古代亦被稱為鞠、黃花、節花、金蕊、壽客等。菊花具有廣泛的用途，除了有極高的觀賞價值外，清香甘甜的茶用菊還具有較好的食用和藥用價值[1]。近年來隨著茶用菊產業的發展，各地茶用菊種植面積不斷擴大，加之菊農長期分散留種、缺乏優選種株的習慣，長期扦插繁殖方式使感染的病毒在種株上不斷積累，導致各地茶用菊出現了明顯的品質劣變、產量降低等種性退化的現象，制約了茶用菊產業的發展。

目前世界上已報道的能夠侵染菊花的(類)病毒大約有20余種，而在中國地區報道過的菊花(類)病毒有8種，分別為菊花B病毒(ChrysanthemumvirusB，CVB)、黃瓜花葉病毒(Cucumbbermosaicvirus，CMV)、煙草花葉病毒(Tomatoaspermyvirus，TAV)、番茄不孕病毒(Tomatoaspermyvirus，TAV)、馬鈴薯X病毒(PotatovirusX，PVX)、馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)6種病毒和菊花矮化類病毒(Chrysanthemumstuntviroid，CSVd)、菊花褪綠斑駁類病毒(Chrysanthemumchloriticmottleviroid，CChMVd)2種類病毒[2]，其中相當一部分的菊花病毒病屬于檢疫性病害，會大面積擴散傳播。因此，對我國茶用菊感染病毒狀況的了解尤為重要。運用快速有效的檢測方法確定茶用菊感染的病毒種類，并對染病植株進行脫毒，使其得到復壯，改善種性退化問題，是解決菊花病毒侵染造成產量和品質低下的關鍵。

福白菊原產地為湖北省麻城市福田河鎮、黃土崗鎮等地，已有300余年的種植歷史[3]，因其花瓣白凈、湯色清亮、芳香甘甜，被譽為茶用菊中的上品。福白菊在麻城常年種植面積達5萬畝，年產量5 000 t以上，產值突破2億元，給當地種植農戶帶來了可觀的經濟效益[3]。近年，福白菊產區已出現普遍的種性退化現象，而福白菊脫毒工作及福白菊脫毒苗在生產上的使用鮮見報道。

植物組織培養技術不僅可用于品種脫毒，還可以在短期內擴繁獲得大量無性系植株[4]，近年來越來越多地應用于菊花快繁[5]。其中，莖尖培養作為植物首選的脫毒技術常與化學藥劑、高溫或低溫處理結合用于種苗脫毒[6]。莖尖再生效率直接影響脫毒的效率。激素的種類與濃度對外植體形成愈傷組織和芽的誘導效果不同，激素配比不當可能會引起愈傷組織褐化、不定芽玻璃化、脫毒苗生根困難等問題[5]，而細胞分裂素和生長素是植物組織培養中較常用的激素，這兩種激素在調控植物組織分裂分化中起著協同作用[7]。

本研究旨在篩查茶用菊品種的染毒情況，并在前期工作[8-9]基礎上優化培養基中不同的激素組合配比，以分析對福白菊莖尖培養脫毒再生效果的影響，同時分析和比較福白菊脫毒苗和非脫毒苗在遺傳穩定性、產量和品質等方面的表現，以期為在生產上推行以福白菊等為代表的茶用菊脫毒苗提供科學依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為南京農業大學中國菊花種質資源保存中心收集保存的24個常見茶用菊品種，取樣地點為南京農業大學江寧湖熟菊花基地。

表1 供試茶用菊品種

1.2 試驗方法

1.2.1 巢式PCR病毒檢測 根據GenBank記錄的中國地區侵染菊花的8種(類)病毒基因序列，即菊花B病毒(CVB)、馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草花葉病毒(TMV)、番茄不孕病毒(TAV)6種病毒，以及菊花矮化類病毒(CSVd)、菊花褪綠斑駁類病毒(CChMVd)2種類病毒，利用Primer Premier 5.0軟件分別對其設計巢式PCR引物各2對。參照Coy等[10]建立的方法進行巢式PCR病毒檢測，目的條帶切膠送至南京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.2 莖尖培養的最適培養基篩選 以MS培養基為基本培養基，設置5組不同激素配方，在每種激素配方上各接種15個福白菊莖尖(重復2次)，統計莖尖出愈率，篩選最適合莖尖生長的激素配方。激素配方為：6-芐基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA，0 mg·L-1)+萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid，NAA，0 mg·L-1)；6-BA(1.0 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)；6-BA(1.0 mg·L-1)+NAA(0.5 mg·L-1)；6-BA(2.0 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)；6-BA(2.0 mg·L-1)+NAA(0.5 mg·L-1)。

1.2.3 低溫處理結合利巴韋林脫毒 參照文獻[8-9，11]，在篩選出來的最適莖尖生長的培養基中添加利巴韋林至終濃度為10 mg·L-1。將4℃低溫處理3個月的福白菊無菌組培苗在M60體視顯微鏡(德國Leica公司)下剝取大小為0.3～0.5 mm并莖尖分生組織，置于添加10 mg·L-1利巴韋林的培養基中，于組培室培養(組培室光照時間為16 h·d-1，光強為36 μmol·m-2·s-1)。

1.2.4 脫毒苗脫毒效果檢測及擴繁 當福白菊脫毒苗生長高度達到5～7 cm后取1～2片葉用于提取RNA，并進行脫毒效果檢測。總RNA的提取按照日本TaKaRa公司提供的RNAiso Plus試劑盒說明書進行，cDNA的合成參照試劑盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit, 日本TaKaRa公司)的說明書進行；將巢式PCR驗證脫毒成功的脫毒苗進行擴繁，切取1～2 cm嫩梢接入MS生根培養基中，在溫度25℃、光照強度36 μmol·m-2·s-1條件下培養15～20 d后可長出新根。

1.2.5 脫毒苗遺傳穩定性分析 分別隨機選取3株脫毒苗及未經脫毒處理的組培苗作為遺傳穩定性檢測材料，參照吳洋洋等[12]的方法利用相關序列擴增多態性標記系統(sequence related amplified polymorphism，SRAP)進行遺傳穩定性分析。

1.2.6 脫毒苗與非脫毒苗生長指標、產量與品質分析 分別以脫毒種株和非脫毒種株為扦插采穗母本，4月下旬扦插，扦插苗生根后，5月上旬定植，株距7 cm。參照于云霞等[13]的方法測定形態指標。

株高：用卷尺測量莖基部至頂端的垂直高度，記錄數據(單位：cm)；

冠幅：用卷尺測量整個植株的冠幅，記錄數據(單位：cm)；

單葉鮮重：用PL602-L電子天平(美國METTLER TOLEDO公司)測量株高25 cm處單個葉片的鮮重，記錄數據(單位：g)；

單葉面積：用Perfection V750 Pro根系掃描儀(日本Epson公司)測量單個葉片的葉面積，記錄數據(單位：mm2)；

葉綠素含量：用FMS2便攜式葉綠素熒光儀 (英國Hansatech公司)測定植株上、中、下3個部分葉片的葉綠素含量，計算取平均值，記錄數據(單位：SPAD);

單株花數：隨機選3株，采用人工計數的方式，分別計數單個植株一、二、三茬花數，累加計算平均數，記錄數據(單位：個)；

單株產量：用PL602-L電子天平(美國METTLER TOLEDO公司)分別稱量單個植株一、二、三茬花的鮮重，累加，記錄數據(單位：g)。

總黃酮含量：參照舒俊生等[14]建立乙醇超聲波提取總黃酮方法，選用Lambda 25紫外分光光度計(美國PE公司)測定其含量。

綠原酸、木樨草苷及3,5-O-雙咖啡酰基奎寧酸(又稱異綠原酸A)的提取與含量測定：參考2015年版《中華人民共和國藥典》中的測定方法，選用超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography，UPLC)(Infinity 1260，美國Agilent公司)進行測定。

1.3 數據統計與分析

采用齊軍山等[15]的方法進行數據統計與分析。試驗數據采用Microsoft Office Excel 2013進行統計與整理，檢測數據滿足正態分布及方差齊性后進行單因素ANOVA方差分析和差異性顯著分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 茶用菊病毒病害調查

利用巢式PCR對24種茶用菊染病情況進行調查，結果表明茶用菊感染了CVB、TAV、CSVd和CChMVd這4種(類)病毒，而另外4種病毒PVX、PVY、CMV、TMV未檢測到條帶。在這24種茶用菊中，感染率最高的為CSVd，感染率高達100%，其次是TAV，其感染率為91.67%，CVB的感染率為87.50%，CChMVd的感染率為66.67%(表2、圖1)。

表2 供試茶用菊樣品染病情況

圖1 感染病毒情況統計

2.2 福白菊的病毒病害表型考察及單株病毒檢測

產區田間種植的福白菊出現了產量降低、品質劣變等種性退化現象(圖2)，福白菊單株取樣的病毒檢測發現CSVd、CVB 2種引物能夠擴增出明顯的目的條帶，而其他6種病毒引物均無目的條帶。CSVd、CVB巢式PCR第二輪產物大小分別為163、381 bp(圖3)。將目的條帶割膠純化，送至南京擎科生物科技有限公司測序，測序結果用BLAST軟件進行序列同源性分析，結果表明，CVB的擴增片段與GenBank中對應序列(EU499736.1)的核苷酸序列同源性達到91%，CSVd的擴增片段與對應序列AB279771.1的核苷酸序列同源性為100%，確定福白菊感染了CSVd。

注：a：健康植株；b：感病植株。

Note: M: Marker DL 2 000. 1～8: CSVd、CChMVd、CVB、TAV、PVY、PVX、TMV、CMV.

2.3 福白菊莖尖最適培養基的確定及脫毒培養

由表3可知，不同濃度、比例的植物激素(6-BA/NAA)對福白菊莖尖的誘導效率不同。當6-BA濃度為1.0 mg·L-1、NAA濃度為0.1 mg·L-1時，福白菊的莖尖誘導存活率最高，達到了60%，未添加植物激素的MS培養基上的莖尖生長較為緩慢且長勢較弱；當6-BA/NAA 為2.0/0.1或2.0/0.5時，部分莖尖形成的愈傷組織分化較慢，且培養后期出現玻璃化、褐化等現象，幼苗較瘦弱，生長狀況明顯弱于其他濃度比例處理的幼苗(圖4)。本試驗處理中福白菊莖尖分生組織誘導培養最適宜的激素配比為6-BA/NAA為1.0/0.1 mg·L-1。

表3 福白菊莖尖在不同濃度植物激素下的誘導存活率

圖4 不同濃度植物激素誘導福白菊莖尖的生長過程

基于激素配比篩選結果，用解剖針剝取4℃低溫培養3個月的福白菊組培苗0.3～0.5 mm的莖尖分生組織，接種至利巴韋林終濃度為10 mg·L-1的MS + 6-BA/NAA(1.0/0.1 mg·L-1)培養基中。圖5為福白菊莖尖分生組織培養1、7、14 d不同階段的生長狀態，當帶1～2片葉原基的莖尖分生組織(圖5-a)接種到培養基中一周后轉綠，逐漸形成膨大的葉原基(圖5-b)；莖尖接種14 d后，葉原基生長形成帶有芽點的嫩芽(圖5-c)，并在后期繼續生長逐漸分化成苗。

注：a: 莖尖分生組織(1 d)；b: 初始形成的小芽(7 d)；c: 莖尖分化成苗(14 d)。

2.4 脫毒效果檢測及脫毒苗的遺傳穩定性分析

運用巢式PCR方法對福白菊的脫毒效果進行檢測，結果如圖6所示。電泳圖上無特異性條帶則說明脫毒成功，有條帶則說明未脫毒成功(反應產物則呈現陽性反應)。結果顯示，1號、2號福白菊組培苗成功脫除CSVd和CVB。

注：a: M: Marker. +: 陽性對照；-: 陰性對照；1和2：CSVd脫毒成功；3和4：CSVd脫毒未成功。b:M: Marker. +: 陽性對照；-: 陰性對照；1和2：CVB脫毒成功；3和4：CVB脫毒未成功。

前期通過預試驗，篩選到16對多態性良好、條帶清晰的SRAP引物組合。利用篩選到的引物對福白菊脫毒苗及未脫毒苗進行SRAP-PCR擴增，由圖7可知，脫毒苗在DNA水平上未檢測到遺傳變異，表明4℃低溫處理及利巴韋林的添加對福白菊的遺傳穩定性無影響。

2.5 福白菊脫毒苗與非脫毒苗產量和品質的比較

由表4可知，來自福白菊脫毒種株的生產苗(以下簡稱脫毒苗)大田表現為株高略矮，冠幅較大；脫毒苗較非脫毒苗大田表現為更加矮壯，不易倒伏，且脫毒苗的單葉鮮重和單葉面積、葉綠素含量較非脫毒苗都有顯著提高。葉面積及葉綠素含量的增加有助于脫毒苗提高光合效率，積累更多光合作用產物。就產量而言，脫毒苗的平均單株花數較多，平均單株產量較組培苗高14.47%(表5)，其估算畝產量也顯著高于未脫毒苗；在內含物的含量上，脫毒苗的總黃酮含量達199.67 mg·g-1，而綠原酸和木犀草苷含量較未脫毒苗也有顯著提高(表6)。

表4 不同種苗對福白菊生長的影響

表5 不同種苗對產量的影響

表6 不同種苗植株內含物的含量

3 討論

菊花作為我國傳統名花有較高的觀賞價值和經濟價值，但在菊花生產中病毒病害十分嚴重，已造成嚴重危害[16-17]。檢測植物病毒的方法有酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、環介導等溫擴增技術[18-19]等。隨著聚合酶鏈式反應的發展，巢式PCR也逐步應用到植物病毒檢測領域。本研究通過巢式PCR檢測方法調查了田間茶用菊病毒病害的感染情況，檢測出了TAV和CVB 2種病毒，以及CChMVd和CSVd 2種類病毒，而其他4種病毒PVX、PVY、TMV、CMV未檢出，可能由于病毒系統間存在交叉保護作用或干涉作用，即當植物被一種病毒侵染，則其同類或近緣病毒就不再感染[20]。本研究確定了茶用菊病毒病害的主要病毒種類，所用巢式PCR方法，靈敏、快速、有效，可以作為田間病毒病害早期診斷以及動態檢測病毒感染、防控病毒的首選方法。通過巢式PCR及后續的BLAST序列比對確定了福白菊感染了CSVd類病毒和CVB病毒，并在南京農業大學菊花課題組前期工作的基礎上確定誘導莖尖培養最適合的6-BA和NAA濃度分別為1和0.1 mg·L-1，誘導存活率較文獻[8-9]的研究結果高6.7個百分點，優化了脫毒效率。

研究表明，在組織培養誘導愈傷組織分化出不定芽的過程中植株容易產生無性系變異[21]，而保持脫毒對象的優良種性直接決定了脫毒種苗能否進行商業推廣。SRAP標記是一種基于PCR的新型分子標記技術，具有簡便、高效、高共顯性、重復性好等優點，利用SRAP分子標記技術能夠快速對脫毒苗和非脫毒苗之間遺傳位點的差異進行高分辨率的鑒別比較[22]。本研究利用前期篩選的16對SRAP引物對福白菊脫毒苗和未脫毒處理組培苗進行SRAP-PCR擴增，未出現任何大小、亮度有差異的條帶，表明脫毒處理對福白菊的遺傳穩定性未產生影響。

由病毒侵染引起的植物病害在全球范圍內造成極大的損失[23]，且單一植株可能同時被多種病毒侵染[24]，導致植株產量、質量的下降，脫毒技術的出現改善了無性繁殖產生的病毒侵染問題[25]。有文獻報道脫毒處理可以顯著提高植物的產量，脫毒的懷菊株系YD5J6與非脫毒的株系相比增產25.17%[26]；脫毒后的滁菊單株產量較非脫毒苗高24.0%[8-9]。周穎媛[27]在懷菊的大田試驗結果也表明脫毒株系的單株鮮重、單株花數及單株分蘗數均有所增加，其中脫毒株系與其對照株系相比，畝產增加16.4%。本試驗中，福白菊脫毒苗在單葉鮮重、單葉面積、葉綠素含量均優于非脫毒苗，脫毒苗單株產量較非脫毒苗高14.47%，表明福白菊脫毒后種源得到復壯，葉綠素水平上升即光合機構的基礎優于非脫毒苗，是其產量提高的原因之一。本試驗中，單株著花量及估算畝產量也得到脫毒苗推廣區大田數據的支持。

經過脫毒處理之后，藥用植物中有效成分的含量也得到了改善和提高。研究表明，脫毒后的懷地黃中的藥用成分梓醇含量較非脫毒苗提高32.90%[28]；脫毒后亳菊的總黃酮、綠原酸等含量都有顯著提升[29]；杭白菊脫毒苗中的綠原酸含量高于藥典中規定的0.2%[30]。本試驗結果表明，福白菊脫毒苗的總黃酮、綠原酸、木犀草苷3種花朵活性成分均高于非脫毒苗。

4 結論

本研究調查了24個茶用菊感染病毒情況，確定了感染較為普遍的4種優勢病毒和類病毒，結果表明，所用檢測方法巢式PCR 靈敏高效，可應用于之后的菊花病毒病害診斷，為這菊花病毒病的檢測奠定了基礎。對感染病毒病嚴重的福白菊進行了脫毒處理，明確了其莖尖誘導最適培養基，優化了脫毒效率。茶菊病毒檢測和病毒脫除操作規程如下：

1)對田間疑似感染病毒的茶用菊使用病毒檢測引物進行PCR確定感染病毒種類；2)對感染病毒植株進行外植體消毒獲得無菌組培苗，并4℃低溫培養3個月；3)在體視顯微鏡下剝取莖尖長度為0.3～0.5 mm的莖尖分生組織，置于含有1.0 mg·L-16-BA、0.1 mg·L-1NAA、10 mg·L-1利巴韋林的培養基中培養；4)對脫毒苗再次進行病毒檢測，將脫毒成功的單株進行擴繁；5)待脫毒苗生根后煉苗，移栽大田。

通過對脫毒苗和非脫毒苗一些生長指標(株高、冠幅、產量、鮮重等)以及內含物(綠原酸、總黃酮、木犀草苷等)的測定，證明脫毒苗的品質、產量都有一定的提高，說明用脫毒種株的種苗進行生產可以達到高產和優質的雙重目的。