生物活性聚合物及其復合材料在骨組織工程中的應用進展

鄭 威，董學明，何 陽，劉彥菊，冷勁松

(1.哈爾濱商業大學 藥學院，哈爾濱 150076；2.哈爾濱工業大學 復合材料與結構研究所，哈爾濱 150080；3.哈爾濱工業大學 航天工程與力學系，哈爾濱 150001)

骨組織由兩種不同的結構組成：松質骨和皮質骨(圖1)。松質骨的內部結構是海綿狀的，具有50%～90%的孔隙率。皮質骨是致密的骨外層，孔隙率小于10%。兩種類型骨形成都需要經歷動態重塑、成熟、分化和再吸收的過程。這些過程通過骨細胞、成骨細胞和破骨細胞之間的相互作用來控制調節[1-2]。成骨細胞主要負責新骨形成，而破骨細胞負責老骨的再吸收。這種涉及破骨細胞和成骨細胞的動態過程稱為骨重建，對于促進骨再生和維持組織結構的完整性具有重要意義。骨組織有良好的自我修復能力，盡管如此，包括創傷、感染、腫瘤和關節置換術后翻修在內的先天性和后天性病變仍然能夠使患者的骨缺損超出身體無法治愈的臨界尺寸[3-5]。這些患者需要通過外科手術將骨代替物移植到骨缺損部位，以幫助骨骼穩定和再生。在歐洲，預計從2010年到2025年骨折的增長率將達到28%[6]。美國與年齡有關的骨折人數預計將從2005年的210萬增加到2025年的300多萬[7]。骨骼是世界上第二大最常被移植的組織，每年至少有400萬次手術使用骨移植物和骨替代材料[8-10]。

圖1 骨組織示意[1]Fig.1 Schematic of bone tissue[1]

目前用于骨修復和再生的臨床治療方法包括使用自體骨移植物和同種異體骨移植物的自體移植和異體移植[11-12]。有大量的研究報告指出了這些療法的局限性和并發癥。自體骨移植物具有組織相容性和非免疫原性，因此成為了骨移植物的黃金標準，并且它們提供了骨移植物材料所需的所有必要性能。具體而言，自體骨移植物具有實現骨誘導(即骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)和其他生長因子)、成骨作用(即骨祖細胞)和骨傳導(即三維多孔基質)的基本成分。但是，自體骨移植需要從患者的其他部位骨骼中獲得，因此需要在組織收集部位進行第二次手術[13]。自體骨移植是非常昂貴的手術，可能導致供體部位的嚴重損傷和發病率,造成畸形、疤痕形成，并且還增加了相關的手術風險：包括出血、炎癥、感染和慢性疼痛等[14-16]。此外，在缺損部位需要的骨量超過可行或可用量的情況下，自體骨移植可能是無效的治療選擇。同種異體移植是第二種最常見的骨移植技術，需要從供體者骨骼中獲取所需骨組織。同種異體骨也具有一定的組織相容性，并且可以根據宿主缺損部位的需要通過多種形式獲得，包括脫礦質骨基質(demineralized bone matrix,DBM)、皮質松質骨和皮質骨移植、骨軟骨和全骨段等。與自體骨移植相比，同種異體移植具有免疫反應和增加感染傳播的風險。它們具有相對較低的骨誘導特性，并且沒有細胞成分，因為供體骨移植物往往需要經過輻射或冷凍干燥等過程，在此期間大部分的酶以及生長因子失活[17-19]。同種異體骨的來源依舊有限，并且手術費用同樣很高。此外，骨移植市場正面臨明顯的供不應求和巨大需求[20]。目前同種異體骨移植材料出現嚴重短缺。其他常用的臨床骨修復輔助技術包括牽拉骨生成、骨水泥填充劑和骨形態發生蛋白等，雖然上述臨床干預措施已被證明可以改善骨修復，但沒有一種具有所有理想的骨修復特性：較高的骨誘導性能和優異的血管生成潛力、生物相容性、低患者發病率、無尺寸限制、外科醫生可隨時獲得、較長的保質期以及合理的成本。

近年來，組織工程的出現為骨缺損的治療提供了新的方向。通過組織工程獲得的骨代替物解決了自體移植物和同種異體移植物資源匱乏的問題。利用傳統聚合物材料以及近幾年新型的形狀記憶聚合物材料制得的骨組織工程支架不僅能為新形成的骨組織提供結構完整性，而且互連多孔結構能夠增強細胞滲透、新組織形成、營養物質運輸以及新血管的形成。新型的形狀記憶支架更能根據患者的不同缺損情況實現個性化“自適應”填充。此外，由于良好的生物相容性，可調節的化學組成和生物降解性，新型的形狀記憶聚合物作為用于制造醫療產品和骨替代物的生物材料是非常有前途的。因此，本文主要綜述了傳統聚合物材料及新型的形狀記憶聚合物材料近些年在骨修復中的應用情況。

1 傳統聚合物材料

傳統聚合物由于其具有良好的延展性、生物相容性以及生物可降解性能等優點，被廣泛使用在制備骨修復支架中。在傳統聚合物支架表面上裝載生物活性分子，可顯著提高細胞在支架上的粘附、增殖和分化。傳統的聚合物如膠原(collagen,Col)、殼聚糖(chitosan,CS)、透明質酸(hyaluronic acid,HA)、絲素蛋白(silk fibroin,SF)、甲殼質(chitin,CI)、明膠(凝膠)和藻酸鹽(alginic acid sodium salt,Alg)及其復合物是資源豐富的生物材料，在骨組織工程中占據著主要地位。

1.1 膠原蛋白(Col)基復合支架

Col是人體內最豐富，分布最廣的蛋白質[21]。在骨組織工程中，從海洋海綿和反芻動物等各種來源獲得的膠原被廣泛地與各種其他材料結合使用，用于制造電紡纖維、支架基質和水凝膠，以幫助靶向輸送生物因子、促進干細胞分化和成骨化[22-23]。利用細菌和酵母大規模合成的重組人樣Col，有助于提高成纖維細胞的相容性和促進骨生長。生物相容性高、基質模擬和可生物降解等特性使其成為骨修復中最常應用的傳統聚合物材料[24-25]。膠原的機械性能和降解特性可以通過交聯過程來定制。然而，與其他傳統聚合物一樣，膠原蛋白的機械性能不足以作為承重支架使用，往往與骨組織工程(bone tissue engineering,BTE)中更堅固的材料結合以產生復合支架。例如，作為骨骼的主要無機成分，羥基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)經常與膠原蛋白結合制備復合支架。

Zhang等[26]通過冷凍干燥后脫水熱處理制備多孔和交聯的Col/HAP復合支架。通過調節Col/HAP比率和脫水熱時期，獲得具有各種孔隙率、機械強度和穩定性的骨修復支架。細胞實驗結果見圖2，成骨細胞在不同含量組成的Col/HAP支架中均有不同程度的粘附和增殖，說明該材料具有良好的生物相容性和可誘導細胞增殖的性能。

圖2 在不同含量組成的Col/HAP支架上成骨細胞培養7 d的共聚焦熒光圖像[26]Fig.2 Confocal fluorescence images of osteoblasts cultured on Col/HAP scaffolds with different contents for 7 d[26]

Villa等[27]通過共沉淀和冷凍澆鑄法制備了膠原-羥基磷灰石(Col-HAP)復合支架。所形成的支架具有99%的孔隙率，高度的滲透性有利于細胞的浸潤和附著。將在小鼠骨髓中獲得的骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)接種到支架上，在體外培養12 h后能觀察到細胞在支架上良好附著。隨后將支架植入小鼠顱骨缺損處，三周后放射影像和礦化分析發現顱骨缺損幾乎完全填充。數周后，宿主的基質金屬蛋白酶會逐漸分解膠原蛋白致使支架逐漸降解完全。為可降解生物支架提供了新的思路。相比之下，Marcacci等[28]發現，將純HAP支架植入4例長骨缺損患者6 a后，存在支架無法降解的情況。Col-HAP支架的機械性能使其最適合于非承重應用，如面部修復[27]，或者應用于輔助治療復雜骨折，就像常用的骨替代品或骨移植一樣，并可以結合機械固定來實現修復目的[29]。

Ren等[30]研究了礦化膠原/糖胺聚糖(mineralized collagen-glycosaminoglycan,MC-GAG)支架。動物(兔)實驗表明，與非礦化膠原/糖胺聚糖支架相比，MC-GAG植入物具有更好的支持骨修復顱骨缺損的能力。如圖3所示，在未重建和Col-GAG重建的缺陷中，在缺損的中心部分發現較小的礦化含量，而MC-GAG支架的中心部分含有更多的礦化骨。

圖3 體內組織學分析Col-GAG和MC-GAG支架植入臨界大小的兔顱骨缺損中的骨修復情況[30]Fig.3 Histologic analysis of in vivo bone healing in critical sized rabbit cranial defects implanted with Col-GAG and MC-GAG scaffolds[30]

1.2 殼聚糖(CS)基復合支架

甲殼質(CI)是最豐富的天然氨基多糖，主要從甲殼類動物(蝦、蟹、龍蝦等)中提取。CI和CS被認為是一種多功能的生物材料。盡管CI具有各種工業應用，但由于其溶解性弱，在骨修復中的使用受到限制。另一方面，脫乙?；腃I衍生物-CS是公認的天然聚合物。它主要包括的單元即(1-4)糖苷鍵連接的D-葡糖胺殘基與隨機定位的可變數目N-乙酰基-D-葡糖胺酶(N-acetyl-glucosaminidase,NAG)基團。CS具有與糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)相似結構，GAG是細胞外基質(extracellular matrix,ECM)中與膠原纖維相互作用并在細胞-細胞粘附中起重要作用的成分之一。CS在骨修復支架制造領域非常重要，因為它具有良好的生物相容性、可生物降解性以及抗菌作用等[31-33]。為了增強CS的性能，聚合物如Alg、Gel、PCL和生物活性納米陶瓷如HAP、SiO2、TiO2、ZrO2等已被用于增加CS生物復合材料的機械強度[34-36]。

Elkholy等[37]開發了一種β-CS/n-HAP復合材料。隨著β-CS的增加力學性能逐漸增大，當重量比達到30∶70時β-CS/n-HAP復合材料獲得了最佳力學性能(抗壓強度為13.05 MP)。此外，研究發現β-CS/n-HAP復合材料在SBF溶液中浸泡8周后，殼聚糖逐漸減少并幾乎消失，說明殼聚糖具有良好的生物可降解性能[38]。動物實驗結果見圖4，復合β-CS/n-HAP作為可生物降解的骨替代物，不僅可以促進骨骼生成，還可以加速Haversian系統的形成。

圖4 對照組和植入組的顯微圖像[37]Fig.4 Microscopic images of control group and implanted group[37]

Wu等[39]通過粒子浸出法后壓縮成型的方式制備了負載殼聚糖/納米羥基磷灰石-阿倫磷酸鹽(CH/nHAP-ALs)微球的多孔聚乳酸/納米羥基磷灰石復合支架系統(CM-ALs)。并對載有0%、10%和20%的(CH/nHAP-ALs)微球的復合支架的表面形態、孔隙率、機械性能、藥物體外釋放和成骨分化性能等方面進行了測試。SEM觀察到支架呈現均勻互相貫穿的多孔結構，孔徑大約在150～250 μm之間。體外細胞實驗表明與多孔聚乳酸/納米羥基磷灰石支架相比，兔脂肪間充質干細胞(rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells,ASCs)在負載殼聚糖載藥微球的支架上培養5 d后發現快速增殖和細胞外基質的生成，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和鈣沉積顯著增加。隨后，將含有質量分數0%和10%的載藥微球多孔復合支架植入兔骨缺損模型中進一步評估體內誘導骨生成性能。在植入4～8周期間，X射線分析發現骨缺損愈合，并伴有新骨形成。含有質量分數10%載藥微球的支架組新骨形成率顯著增高，這一效應隨時間的延長而增強(圖5)。主要是因為阿倫磷酸鹽的持續釋放能長達30 d，提高骨的修復再生能力。這種可以持續釋放藥物并能支持干細胞增殖分化的多孔復合支架，在骨組織工程中具有巨大的應用前景。

圖5 X射線分析CM-ALs(0%)與CM-ALs(10%)植入組新骨形成情況[39]Fig.5 X-ray analysis of new bone formation in CM-ALs (0%)and CM-ALs (10%)implanted groups[39]

1.3 透明質酸(HA)基復合支架

透明質酸(HA)是一種線性高分子多糖，最常被稱為乙酰透明質酸。它由α-1,4-D-葡糖醛酸和β-1,3-N-乙?；?D-葡糖胺的交替二糖單元組成。HA作為一種天然糖胺聚糖，廣泛存在于結締組織、上皮和神經組織中。作為細胞外基質的主要成分之一，既能充當結構元素，也能與結合蛋白、蛋白聚糖和其他生物活性分子相互作用，有助于調節水平衡，而且HA能顯著促進細胞增殖和遷移。它通常具有非常大的分子量(103～107)，適用于硬組織和軟組織工程。HA不僅具有機械性能可調性，同時具有天然的黏彈性，可生物降解性和生物相容性，使其成為骨組織工程的理想材料。此外，它可以通過與細胞表面受體的相互作用來直接影響組織結構，促進細胞遷移和細胞外基質的重塑。事實上，已知HA通過復雜信號通路中涉及各種表面受體與軟骨細胞相互作用使得軟骨細胞能夠維持其原始表型。

Unnithan等[40]將多種材料的有利特性結合起來，制備了一種負載骨誘導藥物辛伐他汀(simvastatin capsules,SV)的氧化石墨烯-殼聚糖-透明質酸(GO-CS-HA)基生物活性復合支架。SV能促使人脂肪干細胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs)來源的成骨細胞分化，提高BMP的表達水平。在該研究中，通過將CS和HA混合溶解，連續攪拌加入GO以產生復合混合物，然后進行冷凍干燥并加入SV，最后將制得的復合支架與N,N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺交聯。電子顯微鏡發現支架具有相互貫通的多孔結構，GO的加入減少溶脹性并有助于增強支架的結構完整性。如圖6所示，在接種第24和48 h后，從FESEM(field emission scanning electron microscope)圖像獲得支架上MC3T3(成骨細胞)細胞的形態和擴散模式。細胞在復合支架上顯示出良好的附著性和優異的鋪展性。在載有SV的GO-CS-HA支架中通過48 h培養后細胞的細長形態證實成骨細胞遷移。此外，在支架上的細胞中觀察到延伸的形態表明成纖維細胞發生遷移，這可以加快組織再生。在整個研究期間，在負載SV的GO-CS-HA支架上觀察到更多細胞。體外礦化實驗分析14 d后在負載了SV的支架中發現更高的礦化水平?？傮w而言，負載了SV的GO-CS-HA的復合支架為骨組織工程提供了一種新的選擇，其中加入的骨誘導藥物能顯著提高生物活性從而誘導骨組織加速形成。

圖6 MC3T3細胞在CS-HA、GO-CS-HA和SV-GO-CS-HA支架上分別培養24 h和48 h附著和增殖的FESEM圖像[40]Fig.6 FESEM images of MC3T3 cell attachment and proliferation on CS-HA,GO-CS-HA,and SV-GO-CS-HA at 24 h and 48 h respectively[40]

HA還被用作骨替代材料中提高生物活性的傳遞劑。Chang等[41]研究了使用HA作為羥基磷灰石/β-磷酸三鈣(HAP-βTCP)顆粒的水性粘合劑是否可以減少所需的骨移植量并在臨床情況下對移植物處理得更為方便。將HAP/βTCP加載到交聯的HA中形成新的HA/HAP-βTCP復合物，然后將其注入體內兔顱骨缺損。組織學和微CT(micro-CT)分析發現，即使HAP-βTCP顆粒數量減少，HA也能維持骨再生。事實上，與對照支架相比，HA/HAP-βTCP樣品在2周后的骨形成量增加了1.7倍?？傊?，向骨移植物中添加HA不僅促進了骨傳導，而且在臨床情況下也改善了處理特性。這為在醫療應用中提供了便利，在組織工程中具有巨大的應用前景。

1.4 絲素蛋白(SF)基復合支架

絲素蛋白是一種典型的纖維蛋白，可形成天然蠶絲的細絲，具有獨特的物理和化學特性。幾十年來，絲纖維一直被用作生物醫學應用中的縫合線，它們是骨組織工程中有吸引力的生物材料。因為它們的性質符合生物材料支架的許多要求，例如緩慢的降解性、高強度和柔韌性，可調節的基因組成和順序，對水和氧的良好滲透性。此外，它們可以在水溶液中加工成凝膠、海綿、粉末和薄膜，并且由于具有氨基和羧基側鏈，因此易于表面修飾進行改性。由家蠶(Bombyxmori)生產的無紡布纖維蛋白網支持包括成骨細胞在內的各種人類細胞生長的能力。工程絲纖維基質已用于韌帶工程，高度多孔的絲海綿已被證明增強了骨髓來源的骨髓間充質干細胞的成骨和軟骨形成作用。

Roohaniesfahani等[42]比較了HAP涂層的SF支架和HAP涂層的膠原支架的性能，他們將兩種支架變體植入大鼠脛骨中，在體內 6周后對支架周圍的骨形成進行組織學分析。他們發現用HAP涂覆的SF支架促進了骨再生以及骨組織與支架融合程度，與HAP涂覆的膠原支架相比，顯示出優異的結果。

此外，在骨組織工程中，SF也經常被用于骨修復支架涂層。Kweon等[43]開發了新型復合陶瓷支架，把納米纖維PCL-SF涂層與雙向磷酸鈣(biphasic calcium phosphate ceramics,BCP)結合形成復合支架，其結構模仿天然細胞外基質，利用PCL和SF的雙重有益效果。評估了納米纖維PCL-SF涂層在增強BCP支架的機械和生物學行為方面的功效。PCL和絲的組合改善了BCP支架的機械強度和生物活性，納米纖維PCL-SF的添加改善了支架抗壓強度(從BCP的0.07 MPa到0.42 MPa)，彈性模量(BCP從5 MPa到25 MPa)，同時還保留了支架的孔隙率(85%)以及孔的連通率(99%)。生物活性方面，與BCP/PCL和BCP支架相比，BCP/PCL-SF支架中的成骨細胞增殖和分化率均有顯著提高。眾所周知，盡管陶瓷支架具有優異的成骨誘導特性，但它們固有的脆性限制了臨床應用。在研究中，已經證明納米纖維PCL-SF涂層可以解決BCP陶瓷支架的脆性并且導致壓縮強度和模量的顯著改善。對于復合支架，雙層改性使BCP支架的破壞應變從小于1%增加至約7%，表明從脆性行為轉變為彈性行為。這些改進的機制基于PCL和SF與BCP的相互作用。SF作為聚合物具有出色的機械強度，而PCL以其優異的韌性而聞名。因此，SF和PCL的組合彌補了BCP支架的特定弱點。為陶瓷類支架的應用提供了一種新的方法，這對于骨組織工程的開發提供了新的道路。

2 新型形狀記憶聚合物材料

近年來，由于形狀記憶聚合物(shape memory polymer,SMP)在醫療、電子、高科技行業以及日常生活中的特殊應用，引起了生物醫藥領域人士越來越多的關注。SMP是一類刺激響應聚合物，加熱狀態下通過對其施加一定外力固定成臨時形狀，再通過外界環境刺激(例如：熱、水、pH、電、磁場、濕度等)從臨時形態轉變為原始形態(圖7)，其中最常見的是溫度響應。SMP由于其低密度、經濟成本、可加工性、可觀的形狀恢復特性[44-45]，被認為是開發新型智能骨組織支架的絕佳選擇。

圖7 形狀記憶過程示意[44]Fig.7 Schematic of shape memory process[44]

SMP多年來已在醫學應用中引起廣泛關注，例如自緊縫合線[46]，組織工程學[47-48]。對于其在微創手術中的潛力也已進行了深入研究，在此過程中，SMP在受到外部刺激后會從緊湊的結構擴展/恢復為原始形狀[49-51]。除了微創植入的潛力外，具有形狀恢復激活時產生的恢復力的SMP支架還可以在骨缺損中提供出色的自適配能力，較小的SMP支架能夠在形狀恢復(膨脹和擴展)后完全匹配骨缺損的邊界[52]。通常，SMP支架的原始形狀適度大于骨缺損的尺寸，從而導致從骨缺損朝向SMP支架的約束力。而骨缺損和支架之間的這種約束已被證明對骨骼向內生長有促進作用[53]。此外，可以通過調節交聯密度或/和摻入納米顆粒來滿足骨再生的要求，從而控制SMP支架的孔互連性和力學性能[54-55]。

聚氨酯(polyurethane,PU)、聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚己內酯(polycaprolactone,PCL)等聚合物具有通過加熱激活的形狀記憶特性，在臨床應用中，其獨特的形狀記憶性能能簡化一些復雜的移植手術過程。此外，出色的化學穩定性，良好的生物相容性和生物降解性使其在骨組織工程中應用更加廣泛。

2.1 形狀記憶聚己內酯(PCL)基復合支架

用于組織工程的具有可調節的轉換溫度(大約體溫)的柔性可降解電活性形狀記憶聚合物(electroactive shape memory polymer,ESMP)的開發仍然是一個挑戰。Deng等[55]基于不同分子量的聚己內酯(PCL)和導電性氨基封端的苯胺三聚體，設計并合成了一系列具有電活性、超強可拉伸性和可調節恢復溫度的形狀記憶共聚物，并證明了它們具有增強成肌細胞(C2C12)分化能力的潛力。形狀回復實驗結果見圖8(a)～(c)，不同分子量的PCL-AT(aniline trimer)共聚物在15 s內均能回復成原始形態。此外，為了研究PCL-AT共聚物的自展開能力，將PCL3000-5AT共聚物固定成一個螺旋形狀(圖8(d))和圓環狀(圖8(f))，然后在接近體溫的溫度下水浴加熱，逐漸回復成原始的長方形(圖8(e)和(g))。這些結果表明，PCL-AT共聚物具有良好的形狀記憶性能，并在自膨脹植入物的應用中具有巨大的潛力。此外，在電活性共聚物薄膜上研究了C2C12成肌細胞的增殖和分化，實驗結果如圖9所示，與分子量為80 000的純PCL相比，它們極大地增強了C2C12成肌細胞的增殖，肌管形成和相關的成肌分化基因的表達。這些具有電活性、可高度拉伸、可生物降解和具有接近體溫附近的玻璃化轉變溫度的形狀記憶聚合物，在骨骼肌組織工程應用中具有巨大潛力。此外，導電聚合物還可以調節細胞行為，例如細胞粘附、增殖、分化等。

圖8 PCL-AT膜的形狀記憶過程[55]Fig.8 Shape memory process of PCL-AT membrane[55]

圖9 在PCL80000，PCL3000-5AT，PCL3000-10AT和PCL3000-15AT上培養5 d后C2C12成肌細胞的細胞活力[55]Fig.9 Cell viability of C2C12 myoblasts after 5 d of cultivation on PCL80000,PCL3000-5AT,PCL3000-10AT,and PCL3000-15AT[55]

組織工程學是目前治療臨界尺寸顱頜面部骨缺損最有效的治療方法，但在支架設計方面仍需改進，可以精確匹配骨缺損不規則邊界、具有相互連通的多孔結構并且具有良好的生物活性,是促進骨組織再生的理想要求。Zhang等[56]通過SCPL方法對聚(ε-己內酯)(PCL)二丙烯酸酯進行光交聯制備了一種形狀記憶PCL多孔支架。施加生物活性聚合物涂層以涂覆孔壁后，支架整體表現出優異的生物活性，明顯促進成骨細胞的粘附、增殖以及成骨相關基因的表達量的提高。形狀記憶實驗結果見圖10，當外界溫度大于PCL的熔融溫度時，支架變軟，延展性增大，施加外力制成不規則缺陷的臨時形狀，冷卻后，支架在缺陷內固定并保持臨時形狀，實現個性化填充。為了評估SMP支架對成骨細胞粘附和增殖能力的影響，將成骨細胞均勻接種并培養在未涂覆的和聚多巴胺涂覆的SMP支架的表面上，培養72 h后，裂解貼壁細胞，并測量和比較DNA水平。結果表明，在聚多巴胺涂覆的SMP支架上的細胞DNA水平比未涂覆的SMP支架高5倍。細胞面積測量結果與粘附結果一致，成骨細胞相對于未涂覆的SMP支架，在聚多巴胺涂覆的SMP支架表面上擴散的程度更大。這種具有自適應形變，并具有高生物活性的多孔支架，在臨床治療中有著巨大的應用情景，為自適應骨組織植入物提供了新的方向。

圖10 聚多巴胺涂覆的形狀記憶多孔PCL支架的自適應過程[56]Fig.10 Self-adaptive process of polydopamine-coated shape memory porous PCL scaffolds[56]

迄今為止，已經有一些關于具有形狀記憶功能的PCL多孔支架的報道。然而，這些研究主要研究了體外SMP的結構和功能。據我們所知，很少有研究報道在體內使用形狀記憶多孔支架修復骨缺損。最近，Liu等[57]制備了一種由化學交聯的聚ε-己內酯(c-PCL)和HAP納米粒子組成的裝載BMP-2形狀記憶多孔納米復合材料支架(SMP支架裝載BMP-2)。HAP納米顆粒的引入不僅可以增加支架的機械穩定性并提供良好的骨電導率[58-59]，而且還可以在體內獲得高質量的微CT支架圖像?；赑CL的形狀記憶支架由于其具有良好的生物相容性和生物可降解性從而備受關注。Liu等制備的具有可控藥物釋放和形狀記憶行為的支架為骨修復組織工程支架的設計和制造提供基礎。體外形狀記憶結果顯示，在37 ℃時，支架能從變形形狀完全恢復至原始形狀，具有優異的形狀記憶效果。此外，Liu等還考察了形狀記憶PCL多孔支架的體內展開過程，為了使動物在麻醉后保持溫度，在42 ℃的溫度/泵上進行植入操作，載有BMP的SMP納米復合材料支架的體內形狀記憶恢復過程見圖11。HAP納米粒子的引入可以像造影劑一樣改善支架的微CT圖像質量，使用錐形束計算機地形學掃描了支架，發現支架在手術后10 min可以從壓縮形狀恢復到原始形狀。與體外恢復過程不同，支架需要更多的時間才能在體內恢復其最終形狀，這可能是由于空氣中的傳熱低于水中的傳熱。然而，這種恢復需要的時間較多可能是有益的，可為臨床治療提供更多的植入時間。通過其與兔骨髓干細胞的相互作用來評估支架的體外細胞相容性，SEM圖像表明，BMSC細胞大部分在支架多孔中生長繁殖，并且細胞附著良好，能在這些孔的壁表面上擴散生長，支架顯示出良好的細胞相容性。骨缺損區域的三維顯微CT圖像和相應的骨形成定量分析用于確定SMP作為骨組織工程支架的可行性。CT結果如圖12所示，與對照組相比，SMP支架組顯示出更多的骨形成。在對照組中，只有較少的新生骨沿缺損側出現，而SMP支架組新生骨占缺損面積的1/3以上。BMP-2的支架組在植入后8周內顯示出缺損區域中新生的骨骼最多，并且填充了一半以上的骨骼缺損區域。SMP智能支架在非常復雜且動態變化的體內環境中解決大體積支架植入方面具有巨大潛力。因此，該研究為設計用于治療或修復患病的人體器官和組織的多功能組織工程支架植入提供了簡便的工程策略。

圖11 錐束計算機斷層掃描觀察的BMP-2加載SMP支架的體內形狀記憶恢復過程[57]Fig.11 In vivo shape memory recovery process of BMP-2-loaded SMP scaffold observed using cone beam computed topography[57]

圖12 骨缺損區域的三維顯微CT圖像[57]Fig.12 3D micro-CT images of bone defect area[57]

2.2 形狀記憶聚氨酯(SMPU)基復合支架

組織工程是治療骨缺損的有前途的替代方法。但是，需要改進支架設計以精確匹配骨缺損的不規則邊界并促進臨床應用。最近的研究中，Yu等[58]通過二苯基甲烷4、4,-二異氰酸酯(diphenyl methane-4,4′-diisocyanate,MDI)，己二酸，乙二醇，環氧乙烷(ethylene oxide,EO)，聚環氧丙烷(poly[oxy(methyl-1,2-ethanediyl)],PO)，1、4-丁二醇合成新型的形狀記憶聚氨酯(shape memory polyurethane,SMPU)。并通過鹽粒子浸出法制備了一種SMPU多孔支架，可通過調節鹽粒子的粒徑來得到不同孔徑的支架，通過掃描電子顯微鏡(SEM)可觀察到0～50,50～110,110～160,160～450 μm不同大小的規則孔徑。支架的孔隙率在77.13%到83.13%之間。通過壓縮測試，熱力學分析和骨肉瘤MG-63細胞實驗分析了支架的機械性能和生物相容性。壓縮測試表明，隨著支架孔徑的逐漸增大，壓縮后支架的回復速率也逐漸加快。體外生物學評價中，Yu等[58]將支架分別剪成6 mm×2 mm大小，與MG-63細胞共混培養于96孔板中，分別培養1、3、5、7 d后通過MTT測定細胞增殖情況。并通過SEM可觀察到細胞在支架中的生長圖像，結果見圖13，與空白對照組相比，MG-63細胞有明顯的增多。該支架不僅具有良好的骨修復機械性能、可調孔徑大小和優異的形狀記憶性能，還具有促進細胞增殖的能力。

圖13 不同孔徑大小的SMPU支架的SEM圖像[58]Fig.13 SEM images of SMPU scaffold with different pore sizes[58]

在過去的幾年中進行了大量的研究以檢查SMP的自適應行為，但絕大多數研究主要集中在體外研究上。Baker及其同事[60]開發了一種基于丙烯酸酯的SMP移植物，該移植物在負重股骨節段缺損模型中用作合成骨替代物。然而，為了成功地將SMP應用于支架輔助的骨再生中，SMP支架在承重骨修復中的體內自適配功能和骨再生能力值得進一步研究。

最近，Xie等[59]通過氣體發泡法制備了一種用于承重骨缺損治療的新型聚氨酯/羥基磷灰石基SMP多孔泡沫。在此之前，SMPU已用于治療腦動脈瘤栓塞。HAP是骨骼組織的主要礦質成分，Xie等充分將HAP的生物活性和SMPU在機械性能、生物相容性和形狀記憶性能結合起來。如圖14所示，通過兔股骨缺損模型證明了SMP泡沫作為骨支架的微創遞送和自適應功能的可行性，植入的SMP泡沫在熱刺激后可能會從緊密的形狀展開以填充骨缺損部位。micro-CT分析顯示，與空白對照組相比，SMP泡沫能顯著加快骨修復。組織學染色進一步表明，SMP泡沫促進了新血管形成和隨后的骨重塑，在SMP泡沫中形成了大量的成熟骨。這項研究證明SMP泡沫由于其優越的性能而可潛在地作為骨支架治療骨缺損。但是，仍需要更多地研究針對長期動物模型，以確定將SMP泡沫用于人骨再生的臨床可行性。

圖14 自適應SMP泡沫用于骨再生支架的示意[59]Fig.14 Schematic of self-adaptive SMP foam as a bone scaffold for bone regeneration[59]

2.3 形狀記憶聚乳酸(PLA)基復合支架

聚乳酸(PLA)是一種熱塑性SMP，由于其高彈性模量，相對較低的玻璃化轉變溫度Tg(55～65 ℃)，良好的形狀記憶性能使得其在3D打印中廣泛使用。長PLA鏈通過物理纏結可以作為固定相，而纏結之間的聚合物鏈可以在變形過程中拉伸成臨時形狀。Lendlein等[46]詳細研究了交聯、化學改性、添加共聚物等可改善PLA形狀記憶特性(例如恢復應力和應變)的方法。近些年來，形狀記憶PLA在醫學應用中受到越來越多的關注。

Senatov等[61]先將PLA和質量分數15%的HAP共混制備成可熔融絲線，再通過3D打印機打印了具有多孔結構的PLA/HAP骨修復支架。對3D打印支架的結構特性、機械性能和形狀記憶效應進行了系統的評估。支架的平均孔徑和孔隙率分別在700 μm和30%左右，能滿足BMSc在支架中生長的結構需求。由于HAP的加入，導致熱傳導速度減慢,材料的Tg也相應地從53 ℃提高到57 ℃。最大恢復應力可達到3.0 MPa。形狀記憶實驗表明，通過直接加熱的方式來驅動形狀記憶效應，PLA/HAP多孔支架能經受連續3次壓縮-加熱-壓縮的循環過程并不會出現分層現象(圖15)，形狀恢復率可達到98%。在加熱過程中形狀記憶效應會使骨修復支架逐漸縮小骨骼裂縫而實現“自我修復”，為自體植入物用于小骨缺損治療提供了新的方向。

圖15 通過壓縮固定3D打印的PLA/HAP支架的臨時形狀，并在加熱到玻璃化轉變溫度以上后演示形狀記憶效果[61]Fig.15 Fixing of a temporary shape of a 3D-printed PLA/HA scaffold through compression,and a demonstration of shape memory effect after heating above the glass transition temperature[61]

隨后，Senatov等[62]對3D打印的PLA/HAP多孔支架進行了體外生物學評價。通過流式細胞儀檢測了MSCs是否存在特征性造血和內皮標記物。MSC通常表達抗原CD105和CD90：分別為69±17.4和71±23.9。這些細胞對白細胞CD45的典型標志物和早期造血細胞標志物CD34呈陰性。光學顯微鏡顯示出成纖維細胞呈現紡錘體形態。細胞接種24 h后，將近30%的細胞固定在支架表面，表明在3D打印的多孔支架表面細胞能快速附著。圖16顯示MSC細胞廣泛分布并與支架表面形成強相互作用。此外，在支架的橫截面中，顯示出在支架的通道內部以及在表面上觀察到聚集的MSC細胞，表明細胞以3D方式生長。通常，細胞需要牢固粘附到基質表面才能擴散、增殖和維持細胞功能。由于PLA/HAP納米復合材料特殊的化學組成，3D打印過程中形成的表面額外微觀結構，較大的表面積和支架的多孔結構為細胞粘附提供了基礎。3D打印的多孔PLA/HAP支架對MSC細胞具有出色的粘合性能，這是其醫療應用的關鍵前提。

圖16 3D打印PLA/HAP多孔支架表面的MSC細胞：HE染色[62]Fig.16 MSC colonization of 3D-printed porous PLA/HAP scaffold surface:HE stained[62]

3 當前面臨的挑戰和發展方向

被認為是下一代組織工程技術的4D生物打印，將“時間”作為第四維納入3D生物打印中，有望構建具有按需動態控制的形狀和功能的復雜結構[63]。在過去的幾年中，隨著刺激響應性生物材料的不斷發展和對組織再生的理解逐漸深入，4D生物打印技術在生物醫學領域和臨床應用中引起了廣泛關注[64]。例如，4D生物打印技術在個性化組織再生領域提供了巨大的應用前景，具有編程形狀和尺寸的4D打印植入物將以精確的幾何形狀自適應填充缺損部位[65-66]。4D打印后的植入物表現出仿生物的功能特征，促進了組織重塑和再生[67-68]。與此同時，近年來計算模型系統的發展為組織工程的個性化設計提供了新的契機。4D生物打印的轉化特征也可以通過構建自我生長結構來幫助治療青少年患者。另外，刺激響應性材料細胞組裝和組織重塑技術可用于藥物遞送和細胞療法的臨床應用[69-71]。一種有效的磁驅動干細胞輸送系統已被應用于脊髓損傷修復中[72]。同樣，這些刺激響應性細胞載體在體內可表現出定向遷移特征，可作為特殊部位損傷修復的臨床適用載體[73]。綜上所述，4D生物打印的形狀和功能轉換特征可以用來設計和控制具有特殊形狀、尺寸、功能、工作部位的打印構建體隨時間的變化，滿足組織工程和臨床應用的要求。這些4D生物打印技術可以為個性化治療和精準醫療提供巨大的潛力，這已被視為組織工程領域的主要趨勢。雖然已經開發了一系列刺激響應的生物材料和多種創新策略，但4D生物打印仍處于起步階段，需要應對多種挑戰。

首先，使現有的刺激響應性生物材料可打印并轉化成生物“墨水”仍然是挑戰。盡管對刺激響應敏感的生物材料的生產制造進行了深入的研究，并且SMP材料的細胞相容性和體內適應性也得到了驗證，但它們直接應用于生物體內難以實現[74-77]。此外，還需要更多的研究來解決4D生物打印的多重挑戰，如打印過程對細胞負載生物支架的負面影響，以及規?；透咄可a的可能性。

其次，現有的4D打印結構的變形過程仍然是簡單的變形，如折疊或組裝，不能滿足臨床應用的復雜需求。在組織工程的廣泛應用中，應進一步提高對形狀轉換和打印分辨率的精確時空控制。當形狀發生變化時，刺激響應材料也需要精確控制內應力的產生或釋放。在長期的應用過程中，應保持其對刺激的響應能力，而不喪失其獨特的特性。Raviv等[78]報道反復折疊/展開會導致打印結構的力學性能明顯下降。這些支架只有在有限的情況下才能完全恢復到原來的形狀。另外，4D打印結構的機械強度通常不足以承受高壓[79]。因此，有必要開發具有強大的形狀轉換特性的4D生物打印結構，尤其是在需要重復響應的情況下。

此外，在進一步應用于臨床實踐之前，還需要克服一些局限性。在刺激響應機制方面仍然有大量的限制，不可以用來觸發變形過程。例如，劇烈變化的紫外線水平和pH值可能是不合適的，因為它們可能對細胞生存能力產生負面影響，而溫度(4～40 ℃)和Ca2+濃度可以改變，但不會對活細胞產生有害影響[79-80]。期望提出相對溫和的四維轉化激發機制或刺激，使4D打印技術對宿主環境更加友好。同時，研究刺激響應材料與免疫系統之間的相互作用也很重要，以促進4D打印結構與受體部位微環境之間的整合。另外，人體組織的現實生理活動要復雜得多，并且細胞活動會受到多種刺激的影響，例如神經調節、體液調節和自我調節。4D打印的生物構建體通常在實現其全部功能之前經歷多個轉化過程[81]。因此，制造在多個刺激下同時經歷復雜的形狀轉換過程和功能轉變的4D打印構建體仍然具有挑戰性。

為了實現組織工程中4D生物打印的精細程序控制，重要的是引入計算機設計技術和復雜的多重刺激響應程序以實現多功能自轉換支架的制造。麻省理工學院設計的Project Cyborg軟件平臺，可提供模擬自組裝和可編程材料以及優化設計結構的功能。然而，這些刺激響應性和可編程生物材料的成本是昂貴的，并且使用復雜的計算機設計系統來設計制造這種智能支架會更為困難。因此，在骨組織工程中如何深入地將4D打印技術與SMP智能材料有機的結合起來仍具有挑戰性。

4 結 論

盡管針對傳統聚合物在治療骨缺損治療的應用進行了大量新穎的研究，但臨界尺寸的骨缺損的患病率卻越來越高，臨床治療仍然存在巨大挑戰，包括定制支架降解速度，結構仿生學不足，支架血管化不夠充分和支架生產規模小。越來越多的研究使用具有生物活性的聚合物復合材料來制造三維支架，已經有效地實現了將材料理想的機械性能和細胞生物特性結合到組織工程的構造中，取得了巨大進展。

SMP具有形狀記憶效應的獨特屬性，包括形狀展開、形狀恢復和形狀自適應，因此SMP在生物醫學領域中發揮著重要作用，以滿足新型外科和醫療設備對材料特殊功能的需求。由于設計多樣性高，可以通過改變其化學和物理結構來開發各種生物醫學形狀記憶材料，以滿足各種應用的需求。此外，除了在溫度的直接或間接驅動下，SMP還可通過pH、溶液、光甚至是多物理場來驅動。具有形狀記憶效應(shape memory effect,SME)和雙向SME的SMP在生物醫學領域更具有巨大的發展潛力。結合其良好的生物相容性、生物降解性、簡單有效的刺激方式和多種SME，SMP有望在生物醫學領域得到廣泛的應用。

4D生物打印技術同其他技術相比可對構造微體系結構提供越來越精確的控制。當與不斷發展的生物活性材料、新型的形狀記憶材料、生長因子、功能化4D打印技術和仿生支架設計相結合時，為患者制造個性化量身定制的復雜骨組織工程支架的潛力是巨大的。這也為治療各種挑戰性疾病提供了希望，包括骨質疏松癥和嚴重的骨缺損。

但為了在將來能實現最大化的促進新骨形成，除了增加構建體的血管形成，還要保證細胞在支架表面以及內部更加緊密的增殖分化。這些往往需要通過對生物材料的進一步修飾、支架的制造方法的改進和模型設計精確程度來實現。還需要更有效的方法來簡化細胞分離、培養和接種到骨支架中的過程。隨著傳統聚合物材料性能的不斷改良，形狀記憶聚合物的變形性能的自適應設計，制造方法的不斷發展，希望將來能夠以越來越具有低成本、無毒且高效的方式來實現個體患者的個性化治療。