LncRNA DANCR 表達與NSCLC 患者鉑類藥物化療敏感性及預后的關系

王超，賈瑞，李健

秦皇島市第一醫院胸外科，河北秦皇島066000

非小細胞肺癌（NSCLC）是一種起源于支氣管黏膜或肺組織的最常見肺癌類型，其發病率和病死率在惡性腫瘤中均位居首位［1］。NSCLC早期癥狀不明顯，多數確診時已進展至Ⅲ～Ⅳ期。化療是晚期NSCLC的主要治療手段，但存在耐藥性差異，患者預后差別較大，而基因表達差異可能是導致腫瘤耐藥的關鍵因素。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一種亞類非編碼RNA，其長度超過200nt，呈明顯的組織特異性及細胞特異性，具有維持基因穩定性、調控細胞增殖及改變染色體結構的作用［2-3］。分化拮抗非蛋白質編碼RNA（DANCR）主要位于染色體4q12，存在于細胞質內，在胃癌、乳腺癌中呈高表達，與癌細胞增殖、凋亡和耐藥性密切相關［4］。研究表明，在乳腺癌組織中，LncRNA DANCR 能靶向結合miR-216A-5P，從而激活胚胎轉錄因子八聚體結合轉錄因子4（OCT4）和性別決定區Y 框蛋白2（SOX2），使癌細胞增殖速度加快［4］。既往研究表明，LncRNA DANCR能參與上皮-間質轉化（EMT）過程［5］。目前，LncRNA DANCR 對NSCLC 的預后及化療敏感性報道罕見。因此，本研究旨在探索NSCLC 組織LncRNA DANCR表達與鉑類藥物化療敏感性及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取本院2016 年1 月—2017 年11月收治的126例NSCLC患者，其中男68例、女58例，年齡（58.67 ± 9.14）歲；腺癌50 例、鱗癌61 例、其他類型癌 15 例；中分化 34 例、低分化 92 例；Ⅲ B 期 43例、Ⅳ期83 例；吸煙66 例、不吸煙60 例。納入標準：①符合《國家綜合癌癥網絡（NCCN）關于NSCLC的臨床實踐指南2009版》［6］中關于ⅢB～Ⅳ期診斷標準，且由病理檢查證實（經皮穿刺或支氣管鏡取活檢）；②NSCLC患者自愿配合整個化療過程，并按時回院接受隨訪復查，且基本資料完整；③既往無放化療史和肺部手術史；④能耐受化療過程且對化療藥物不過敏者。排除標準：①合并肺結核、重度慢性阻塞性肺疾病及嚴重支氣管擴張者；②合并胃癌、食管癌及結腸癌等惡性腫瘤者；③伴有免疫系統缺陷者；④肝、腎功能不良者。隨訪時間均為1～36個月，起始時間至截止時間為2016年1月—2020年11月，期間無失訪病例。NSCLC患者均于試驗前簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會審核通過（編號2020F036）。

1.2 治療方法 支持治療：為患者準備合理的飲食搭配；患者入院化療期間對其進行心理健康輔導，增強治療信心；盡量減少抗生素及糖皮質激素的使用。化療方案［6］：采用常規鉑類藥物聯合新型化療藥物（多西他賽聯合順鉑）化療。其中多西他賽（杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司；規格：20 mg/支）劑量為75 mg/m2，于第1 天靜脈滴入1 h，而順鉑（齊魯制藥有限公司；規格：10 mg/支）劑量為75 mg/m2，于第1 天經5%葡萄糖溶液稀釋后靜脈滴入。21 d為1個周期，共治療2個周期。NSCLC患者均行肺部CT 掃描，依據RECIST1.1 實體瘤療效標準［7］評估2 個周期的化療情況。完全緩解（CR）：原病灶完全消失，且未出現新發病灶，腫瘤標志物維持正常水平超過4 周。部分緩解（PR）：原病灶最大徑之和較前減小≥30%，且至少4 周未見增大。病情穩定（SD）：原病灶最大徑之和較前減小＜30%或增大＜20%。病情進展（PD）：原病灶最大徑之和較前增大≥20%，或病灶數量較前增多。化療敏感=CR+PR，化療不敏感=SD+PD。

1.3 LncRNA DANCR 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。癌組織經皮穿刺或支氣管鏡取NSCLC組織及正常肺組織（癌旁5 cm 處），經液氮速凍后統一置于-80 ℃冰箱。樣本均采集30 mg，于冰上均勻研磨，向其中滴加1 mL TRIzol 試劑（Invitrogen 公司；批號20151223）提取總RNA。通過反轉錄Prime-ScriptTMRT Master Kit 試劑盒（Fermentas 公司；批號20151229）合成cDNA。利用SYBR Premix Ex TaqTM［寶生物工程（大連）有限公司；批號20151230］檢測LncRNA DANCR表達。LncRNA DANCR反應條件均為 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。PCR 擴增體系：SYBR Green 10μL、sense primer 1μL、antisense primer 1μL、ddH2O 6μL及cDNA 2μL，共計20μL。LncRNA DANCR正向引物序列為5'-CGTCTCTTACGTCTGCGGAA-3'、反向引物序列為5'-TGGCTTGTGCCTGTAGTTGT-3'，內參基因GAPDH 正向引物序列為5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'、反向引物序列為5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。 LncRNA DANCR 的PCR反應條件為預變性95 ℃ 5 min、變性95 ℃ 5 s、退火55 ℃ 1 min、延伸72 ℃ 1 min，共擴增40 個循環，樣本均設置3個復孔。引物序列由上海康成公司負責合成。以相對Ct 值法檢測LncRNA DANCR 的表達量，以ΔCt 值為結果，相對于 GAPDH 的比值為 2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。計量資料符合正態分布以表示，多組間比較應用方差分析，兩組間比較應用獨立樣本t檢驗。Kaplan-Meier 生存分析不同LncRNA DANCR 表達患者的生存差異，生存率比較采用Log-rank 檢驗。通過Cox回歸模型分析患者預后影響因素。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 及癌旁正常組織中LncRNA DANCR 的表達比較 NSCLC 及癌旁正常組織中LncRNA DANCR 的相對表達量分別為 3.65 ± 1.41、1.52 ±0.67，二者比較，P＜0.01。

2.2 NSCLC 組織中LncRNA DANCR 表達與患者臨床病理特征的關系 LncRNA DANCR 表達與組織分化程度和 TNM 分期有關（P均＜0.05），而與患者年齡、性別、吸煙及腫瘤病理類型無關（P均＞0.05），見表1。

表1 NSCLC組織中LncRNA DANCR 表達與患者臨床病理特征的關系（）

表1 NSCLC組織中LncRNA DANCR 表達與患者臨床病理特征的關系（）

臨床病理特征年齡（歲） 0.186 ＞0.05≥60＜60吸煙n LncRNA DANCR t/F P 70 56 3.67±1.19 3.63±1.21 0.217＞0.05是 否66 60 3.63±1.02 3.67±1.05組織分化程度 4.626 ＜0.05中分化低分化性別 0.105 ＞0.05 34 92 2.85±1.06 3.95±1.47男 女68 58 3.66±1.02 3.64±1.11病理類型 0.076 ＞0.05腺癌鱗癌其他類型癌TNM分期 4.927 ＜0.05ⅢB期Ⅳ期50 61 15 3.61±1.03 3.67±0.91 3.70±0.96 43 83 2.91±0.83 4.03±1.72

2.3 不同化療效果患者癌組織中LncRNA DANCR表達比較 患者均經2 個周期的化療，化療敏感者50 例，LncRNA DANCR 癌組織中相對表達量為2.93 ± 1.01，化療不敏感者 76 例，LncRNA DANCR相對表達量為4.12±1.67，二者比較，P＜0.01。

2.4 NSCLC 癌組織中LncRNA DANCR 表達與患者預后的關系 以NSCLC 癌組織中LncRNA DANCR表達量的中位數3.66 為臨界值，其中高表達者65例，低表達者61 例，高表達者、低表達者的3 年總生存率分別為 12.31%（8/65）、29.50%（18/61），LncRNA DANCR 高表達者的3年總生存率較低表達者低（χ2=6.150，P=0.013）。

2.5 NSCLC 患者預后影響因素的Cox 回歸模型分析 Cox 回歸分析顯示，TNM Ⅳ期、低分化、鉑類藥物耐藥及LncRNA DANCR 高表達是影響NSCLC 患者預后的獨立危險因素（P均＜0.05），見表2。

表2 NSCLC患者預后影響因素的Cox回歸模型分析

3 討論

循證醫學調查發現，我國每年肺癌新增病例約70 萬例、死亡病例約60 萬例，新增病例中以NSCLC最常見，占 80%～85%［1］。NSCLC 是多種因素協同并經歷多個步驟所致，與空氣污染、易感基因、職業性質及吸煙密切相關［1］。對于晚期NSCLC，因患者基本上已發生轉移，預后較差，放化療是控制其進展、延緩患者生存時間的主要手段。目前，以鉑類化療為基礎聯合其他新型化療藥物（多西他賽、吉他西濱、阿法替尼及培美曲塞等）是臨床常用的化療方案，其療效與患者的耐藥性密切相關［6］。近年來，基因組學和分子生物學已成為腫瘤領域的研究熱點，DNA 甲基化、LncRNA 及組蛋白修飾等過程對腫瘤的起病和進展至關重要。它們能阻遏或誘導原癌基因的表達，改變腫瘤微環境，從而影響腫瘤演變的進程及對化療藥物的敏感程度［8-9］。

LncRNA 是一種不能編碼蛋白質的RNA，不具有完整的開放閱讀框，通過競爭性抑制內源競爭性RNA、調控轉錄因子、修飾基因甲基化等方式調節細胞分裂、分化、增殖等過程［9］。LncRNA DANCR 于2012 年首次被發現，由915 個堿基組成，具有3 個轉錄本，對細胞的終末期分化具有明顯的抑制作用［10］。同時，在軟骨的損傷修復、牙髓細胞分化及成骨分化中有重要的調控作用［10］。研究表明，在前列腺癌組織中，LncRNA DANCR 靶向調控多梳抑制復合物2（PRC2），使侵襲關鍵基因TIMP2/3 的啟動子發生甲基化，導致其轉錄過程受阻，從而促進癌細胞發生轉移［10］。GUO 等［11］發現，LncRNA DANCR 具有miRNA 海綿的作用，通過吸附miR-27a-3p 激活Rho 的卷曲螺旋激酶 1（ROCK1）/沉默 LIM 激酶 1（LIMK1）/絲切蛋白1（COFILIN1）信號通路，從而加速肝癌進展。本研究結果顯示，NSCLC 組織中LncRNA DANCR 高表達，提示 LncRNA DANCR 可能參與NSCLC 的癌變過程。其原因可能為NSCLC 組織中的抑癌基因異常，使LncRNA DANCR 的啟動子無法甲基化，導致啟動子活性增加，提高LncRNA DANCR 轉錄速度，使 LncRNA DANCR 表達上調［12］。本研究結果表明，LncRNA DANCR 表達與組織分化程度和TNM 分期有關，提示LncRNA DANCR 在NSCLC 的演化過程發揮重要調控作用。其原因可能為LncRNA DANCR 過表達誘導核受體視黃酸X受體α（RXRA）發生磷酸化，促進磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α（PIK3CA）轉錄，同時激活磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）/絲蘇氨酸激酶（AKT）信號通路，縮短其細胞周期，促進癌細胞迅速分裂、分化［13］。此外，上調的LncRNA DANCR 能促進細胞啟動EMT 過程，使癌細胞易于穿透細胞外基質，增強其侵襲和遷移能力［4］。

鉑類藥物的抗腫瘤機制主要通過結合癌細胞的核內DNA，使其DNA 損傷，減緩癌細胞的增殖速度和侵襲程度［14］。鉑類藥物在NSCLC 化療初期癥狀顯著，但隨著化療周期的持續，其效果逐漸下降，其中癌細胞的多藥耐藥性是影響化療效果的主要因素，但其作用機制復雜，包含多種基因、信號通路，目前尚不清楚［14］。在動物體內實驗中［15］，將攜帶 LncRNA DANCR 干擾序列的病毒載體注射至裸鼠體內后，其內癌細胞生長速度明顯減慢，同時，對細胞毒性藥物的敏感性增加。本研究結果表明，化療不敏感患者LncRNA DANCR 表達均高于化療敏感者，提示LncRNA DANCR 過表達時，癌細胞對化療的敏感度減低。其具體機制目前尚不清楚，可能與癌細胞啟動 EMT 使自身惡性程度增加有關［4，12］。研究發現，過表達的LncRNA DANCR 能誘導細胞去分化或使細胞發生“干性獲得”，從而使腫瘤起始細胞數量明顯增加，而腫瘤起始細胞能通過不斷修復損傷的DNA 而對鉑類化療藥物產生抵抗作用，最終導致癌細胞對化療的敏感度減低［15］。Kaplan-Meier 生存曲線結果顯示，當LncRNA DANCR 表達上調時，患者的預后時間更短，提示LncRNA DANCR 表達確實與NSCLC 患者預后生存周期有關。同時，Cox 回歸分析進一步指出LncRNA DANCR 與NSCLC 患者預后有關，提示LncRNA DANCR 是預測患者預后生存時間的潛在標志物。

綜上所述，NSCLC 組織中 LncRNA DANCR 呈高表達，且與組織分化程度和TNM 分期有關，有助于預后評估，對化療敏感性有一定影響。