體外助孕中未成熟卵子比例過高的臨床因素分析

司蕊，盛燕，李靜，高姍姍

山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院 山東大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心 國家輔助生殖與優(yōu)生工程技術(shù)研究中心生殖內(nèi)分泌教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250021

體外助孕過程中，需通過合適的促排卵用藥獲得一定量的成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精。而獲得卵子的成熟比例低或卵子成熟度差，往往影響整個體外助孕的結(jié)局。卵子成熟是一個復(fù)雜精密的過程。研究顯示，諸多卵子成熟的關(guān)鍵基因缺失或表達(dá)異常可能導(dǎo)致女性無法產(chǎn)生成熟卵子［1］。但除外這些內(nèi)在原因所致的卵子成熟問題，臨床生殖醫(yī)師通常發(fā)現(xiàn)促排卵方案、降調(diào)藥物與拮抗劑藥物的使用等均可能影響獲得卵子的成熟比例。本研究通過對2017 年—2018 年卵子成熟比例低于40%的卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（ICSI）助孕周期與對照組進(jìn)行回顧性隊(duì)列分析，旨在發(fā)現(xiàn)可能影響卵子成熟比例的相關(guān)臨床因素，以期對輔助生殖的臨床工作提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2017 年1 月—2018 年12 月于山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院女性生殖科因男方因素行ICSI 助孕周期，并按相應(yīng)條件分成兩組，未成熟卵組：①獲卵數(shù)＞3；②獲卵中未成熟卵（減數(shù)第一次分裂MI 期或生發(fā)泡GV 期卵）占60%以上。共納入155 例周期（發(fā)生率1.2%）。成熟卵組：按年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）匹配后以1∶3 配對選取獲卵數(shù)＞3 的卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)胚胎移植（ICSI-ET）周期中成熟卵比例90%以上的周期。本研究經(jīng)山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)通過。患者均簽署知情同意書。

1.2 促排卵方案 根據(jù)患者年齡、體質(zhì)量、卵巢儲備指標(biāo)等制定促排卵方案。控制性超促排卵（COS）方案：應(yīng)用本院常用的促排卵方案，包括黃體期長方案、短方案、拮抗劑、其他方案。黃體期長方案：在取卵周期前1 個月經(jīng)周期的黃體中期，應(yīng)用促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa）0.05～0.1 mg/d 垂體進(jìn)行降調(diào)節(jié)，13～14 d 后行陰道超聲檢查并抽靜脈血測血清。當(dāng)達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)時，根據(jù)患者年齡、竇卵泡大小與個數(shù)、體質(zhì)量指數(shù)，抗苗勒氏管激素（AMH）及血清激素水平?jīng)Q定啟動促性腺激素（Gn）的劑量，直至人絨毛膜促性腺激素（HCG）注射日。定期監(jiān)測卵泡發(fā)育情況及血清促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）水平，當(dāng)患者雙側(cè)卵巢至少有2～3 個主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm 時，肌注 HCG 誘發(fā)排卵，注射HCG 36 h 后在B 超引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵。短方案：月經(jīng)第2～4 d開始使用短效GnRHa 0.1 mg直至 HCG 日，GnRHa 后 1～2 d 開始 Gn 促排卵，Gn 的啟動量及調(diào)整，扳機(jī)時機(jī)同長方案。拮抗劑方案：月經(jīng)第1～4 天開始給予Gn 啟動。并根據(jù)卵泡大小及激素水平靈活添加拮抗劑：主導(dǎo)卵泡直徑≥11～12 mm，和/或LH＞10 IU/L（或大于基線水平2 倍）或E2水平＞200～300 pg/mL時添加促性腺激素釋放激素拮抗劑（GnRH-A）0.125～0.25 mg/d。當(dāng)患者雙側(cè)卵巢至少有1～2 枚個主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm 時，肌注HCG 或GnRha+HCG 扳機(jī)誘發(fā)排卵。從促排卵方案使用比例、用藥、卵泡大小比例、不同階段各激素水平及取卵時機(jī)等方面比較兩組情況。

1.3 卵子成熟度的確定 取卵后每位患者均按常規(guī)行ICSI 進(jìn)行授精。行ICSI 的卵子于取卵后4 h 用透明質(zhì)酸酶去除顆粒細(xì)胞，確定卵母細(xì)胞的成熟度，選取MII期卵母細(xì)胞行ICSI操作。

1.4 實(shí)驗(yàn)室及妊娠結(jié)局計(jì)算 受精率=2PN（PN）數(shù)/MII 卵數(shù)；放棄周期率=無可移植胚胎及凍胚周期數(shù)/總周期數(shù)；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期/移植周期。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)、t'檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Logistic 回歸分析各參數(shù)與未成熟卵比例高的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 未成熟卵組與成熟卵組周期數(shù)分別為155、480 個，原發(fā)不孕比例分別為57.42%、43.75%，第1 周期比例分別為56.77%、65.21%，未成熟卵組的原發(fā)性不孕比例較高（P＜0.05），余各項(xiàng)指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見表1。

表1 未成熟卵組與成熟卵組患者基本情況比較（）

表1 未成熟卵組與成熟卵組患者基本情況比較（）

參數(shù)不孕年限（年）年齡（歲）基礎(chǔ)FSH（IU/L）基礎(chǔ)LH（IU/L）基礎(chǔ)E2（pg/mL）基礎(chǔ)T0（ng/mL）體質(zhì)量（kg）BMI（kg/m2）未成熟卵組4.19± 3.07 31.58± 4.61 6.64± 2.13 5.00± 2.89 37.32±15.65 0.25± 0.15 61.72± 8.41 23.78± 3.31成熟卵組4.16± 3.34 31.99± 4.71 6.62± 1.96 5.35± 3.73 36.31±14.45 0.24± 0.14 61.55± 9.16 23.84± 3.53 P 0.919 0.350 0.424 0.862 0.119 0.203 0.846 0.843

2.2 兩組促排卵相關(guān)參數(shù)比較 見表2。

表2 未成熟卵組與成熟卵組促排卵相關(guān)參數(shù)比較

2.3 未成熟卵比例高的多因素Logistic 回歸分析 促排卵方案、≥18 mm/14～17 mm 卵泡比例、HCG 日14 mm 以上大卵泡平均E2 是未成熟卵比例高的獨(dú)立危險因素（P均＜0.05）。

3 討論

促排卵是體外助孕過程中重要的一環(huán)，通過對方案的選擇，藥物種類及劑量的把控及對卵泡大小、性激素的監(jiān)測來獲得體外助孕所需的一定量的成熟優(yōu)質(zhì)卵子。目前在COS 過程中，通過卵巢儲備、年齡、體重及既往促排卵反應(yīng)等因素決定促排卵方案、Gn 啟動劑量等，在 COS 過程中，通過 B 超、激素水平監(jiān)測決定扳機(jī)時間。但由于患者的個體差異、醫(yī)師促排卵經(jīng)驗(yàn)差異等各種因素，可能出現(xiàn)最終獲卵少、獲卵中未成熟卵比例增加等情況。卵子成熟比例下降明顯影響周期結(jié)局，本研究發(fā)現(xiàn)在未成熟卵組，即使是成熟卵子的受精率較對照組亦有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在未成熟卵比例較高的周期中同批所獲得成熟卵子也可能存在胞質(zhì)成熟不同步的可能。周期結(jié)局顯示未成熟卵組的放棄周期遠(yuǎn)高于對照組（46.45%vs 7%），周期平均凍胚數(shù)亦明顯減少。因此，體外助孕治療中獲得較高比例成熟卵子是非常重要的。本研究擬從臨床角度出發(fā)，分析獲卵中未成熟比例較高患者本身的基礎(chǔ)特征、促排卵過程的具體指標(biāo)等因素，以期發(fā)現(xiàn)體外助孕中不同促排卵方案中可能導(dǎo)致未成熟卵比例增加的原因，以指導(dǎo)臨床工作。

正常狀態(tài)下，COS 周期中獲得的卵母細(xì)胞中15%左右在減數(shù)分裂Ⅰ期（MI）或是生發(fā)泡期［2］。獲得高比例的未成熟卵的周期大部分是由于患者本身因素或促排卵過程中控制不良所致［3］。本研究總體資料的基礎(chǔ)情況顯示，未成熟卵組的原發(fā)性不孕患者比例較高，提示未成熟卵組中存在患者本身因素。卵子質(zhì)量與患者年齡呈明顯相關(guān)性［4］，而獲卵數(shù)與年齡可能也存在一定關(guān)系［5］。本研究中主要分析促排卵過程的相關(guān)指標(biāo)對卵子成熟的影響，對照組已按年齡配比，以排除年齡因素的影響。

分析整體的促排卵情況發(fā)現(xiàn)，短方案比例在成熟卵組明顯高于未成熟卵組。由于短方案存在Gn-RHa 的短時激發(fā)作用，對于垂體的抑制較輕，LH 維持于一個較高的水平［6］。多因素回歸分析印證，相較于長效降調(diào)方案，短方案更有利增加卵子成熟比例。另一發(fā)現(xiàn)為未成熟卵組Gn總量高于成熟卵組，同時未成熟卵組的大卵泡相對比例（≥18 mm/14～17 mm 卵泡）低于成熟卵組。這提示未成熟卵組的卵巢反應(yīng)性較差，致使卵泡發(fā)育不均，成熟卵比例降低。回歸分析發(fā)現(xiàn)，扳機(jī)日E2/成熟卵泡數(shù)也是未成熟卵比例高的相關(guān)因素，這與王麗等［7］研究結(jié)論一致。

不同的COS 方案對內(nèi)源性LH 的調(diào)控機(jī)制的不同，整體的分析難以發(fā)現(xiàn)不同方案的特征性問題。因此，本研究對長方案、短方案及拮抗劑方案三種常規(guī)方案進(jìn)行了亞組分析。長方案資料分析，扳機(jī)日18 mm 以上大卵泡比例有下降趨勢，提示有非預(yù)期的卵巢低反應(yīng)發(fā)生而增加了未成熟卵比例。短方案資料分析發(fā)現(xiàn)，基線參數(shù)比較提示未成熟卵組的竇卵泡個數(shù)較少，提示該組卵巢儲備差，促排卵情況的比較亦顯示了臨床醫(yī)師針對該組較低儲備的情況增加了啟動量及扳機(jī)HCG 用量，但扳機(jī)日大卵泡比例及雌激素水平提示仍發(fā)生了卵巢低反應(yīng)的情況。綜上兩種方案，患者的預(yù)期或非預(yù)期的卵巢反應(yīng)不良，卵泡發(fā)育不均勻，都可增加卵子不成熟比例。拮抗劑方案的數(shù)據(jù)分析提示，未成熟卵組的基礎(chǔ)LH 水平低于成熟卵組，而促排卵過程中使用GnRHant 總量反而高于成熟卵組，同時未成熟卵組拮抗劑使用天數(shù)較成熟卵組有延長趨勢。提示在拮抗劑方案未成熟卵組中，存在自身LH 功能基礎(chǔ)的相對不足，和/或存在過早或過量地使用拮抗劑導(dǎo)致繼發(fā)的LH過低情況。

卵泡直徑是評估卵子發(fā)育潛能的重要指標(biāo)［3］。較小的卵泡其卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟差，發(fā)育潛能差［8］。HAINES 等［9］研究指出，在直徑 15～23 mm 卵泡中獲得的卵母細(xì)胞能獲得最為正常的妊娠。而從直徑大于23 mm 的卵泡中取卵，獲卵數(shù)下降［10］。這導(dǎo)致非同步發(fā)育的卵泡群中過大卵泡不易獲得卵子，而較小卵泡獲得未成熟卵或發(fā)育潛能差的卵子，從而影響助孕結(jié)局。因此，同步發(fā)育的主導(dǎo)卵泡群是獲得優(yōu)質(zhì)卵子和胚胎的關(guān)鍵因素。最大卵泡直徑無法體現(xiàn)總體卵泡群的發(fā)育情況及卵泡發(fā)育的同步性。因此本研究采用18 mm/14～17 mm 卵泡數(shù)這一參數(shù)。多元回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，18 mm/14～17 mm 卵泡數(shù)下降是未成熟卵比例增加的相關(guān)因素，與李媛［3］研究結(jié)果一致。

LH 是卵泡發(fā)育成熟不可或缺的一環(huán)，LH 不僅能促進(jìn)卵泡的生長，還能觸發(fā)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂恢復(fù)，促進(jìn)卵母細(xì)胞的最后成熟。促排卵過程中低LH 會導(dǎo)致FSH 用量增大、促排卵時間延長、獲卵率低、受精下降、降低妊娠結(jié)局等［11］。本研究中扳機(jī)日E2/成熟卵泡數(shù)比值下降即為LH 相對不足的體現(xiàn)。超促排卵中由于降調(diào)或拮抗劑應(yīng)用后導(dǎo)致的LH 相對低同時繼發(fā)的卵巢反應(yīng)不良及卵泡不同步現(xiàn)象。而本研究中拮抗劑方案未成熟卵組體現(xiàn)了過早/過量地使用拮抗劑的情況。但同時不排除不孕癥患者存在LH 受體表達(dá)異常，由于患者LH 受體水平的個體差異，導(dǎo)致LH 相對低的現(xiàn)象［12］。研究已證實(shí)，在LH 受體的變異（V-βLH 攜帶者）［12］患者或低預(yù)后人群［13］添加LH有利于改良卵巢反應(yīng)及妊娠結(jié)局。

有研究發(fā)現(xiàn)對于長方案獲卵數(shù)較少者，HCG 扳機(jī)后延遲取卵時間可增加MII 卵子數(shù)［14］。本研究中，兩組無論是整體分析還是不同促排卵方案中分析均未發(fā)現(xiàn)扳機(jī)至取卵之間時間有差異，這可能是常規(guī)臨床工作的統(tǒng)一控制有關(guān)。是否延遲時間取卵，并且延遲多長時間能增加成熟卵比例需要進(jìn)一步前瞻性研究。本研究回顧性分析了155 例未成熟卵比例大于60%的體外助孕周期，一方面樣本量較小，另一方面由于無法排除部分患者是否存在內(nèi)源性因素（如LH 受體表達(dá)異常等），從而不能更有效地分析促排卵臨床相關(guān)原因。對于連續(xù)卵子成熟比例低的患者，可考慮行已知相關(guān)基因的檢測。

綜上所述，促排卵過程中由于各種原因造成的卵泡發(fā)育不同步，以及由于各因素導(dǎo)致的LH 低水平是導(dǎo)致成熟卵比例下降的相關(guān)因素。短方案的特點(diǎn)可能更有利于增加成熟卵的比例。扳機(jī)日18 mm/14～17mm 卵泡數(shù)能更好評估主導(dǎo)卵泡群的同步性。