一株雞源性沙門氏菌的基因組分析

宋 晟,張海韻,郭焜鵬,王芳斌

(食品安全監測與預警湖南省重點實驗室湖南省食品質量監督檢驗研究院,中國湖南長沙410117)

沙門氏菌是一種嗜溫性、兼性厭氧、無芽孢、無莢膜的革蘭氏陰性桿菌,在自然界中廣泛分布,為食源性細菌性腸胃炎的首要病原菌。典型沙門氏菌菌株多具有周生鞭毛,能運動、能分解葡萄糖并產氣[1～2]。當前,全球每年因食品中沙門氏菌污染而引起的感染病例數以億計,生熟不分是家庭內流行最常見的原因。在國家衛生系統的全國食物中毒事件情況通報中,沙門氏菌引起的食物中毒占總數的50%以上。我國食品安全國家標準中規定,各類預包裝食品中不得檢出沙門氏菌,但對于生鮮肉制品并無沙門氏菌的限量要求。目前,各地各類生鮮肉制品中沙門氏菌的分布情況和檢出情況均有所不同[3～4]。本研究從湖南省長沙市生鮮市場處采購生鮮雞肉,依據《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》(GB 4789.4—2016),分離鑒定出一株沙門氏菌(FC10727),并對其進行全基因測序與生物信息學研究,可為沙門氏菌基因層面的深入研究提供一定的實驗基礎,為科學防范、食品安全監管、政策制定提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

生鮮雞肉(2 kg)購于湖南省長沙市雨花區一生鮮市場。

緩沖蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)、四硫酸鈉煌綠增菌液(tatrathionate broth base,TTB)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(selenite cystine broth,SC)和HE瓊脂(Hektoen enteric agar)均購自青島海博生物技術有限公司;亞硫酸鉍瓊脂(bismuth sulfite agar,BS)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(xylose lysine desoxycholate agar,XLD)、營養瓊脂(nutrient agar,NA)以及三糖鐵瓊脂(triple sugar iron agar,TSI)購自北京陸橋技術股份有限公司;沙門氏菌顯色培養基和革蘭氏陰性細菌鑒定卡(Gram-negative identification card,GN)購自法國Chromagar公司。

1.2 增菌

生鮮雞肉按照500 mL/kg的比例加入BPW,對生鮮雞肉進行充分的潤洗,反復揉搓2～3 min后(36±1)℃培養18 h。吸取1 mL BPW培養物轉種到10 mL的TTB中,(42±1)℃培養24 h;另吸取1 mL BPW培養物至10 mL SC中,(36±1)℃培養24 h。

1.3 分離

用無菌接種環從TTB選擇性增菌液與SC選擇性增菌液中分別取增菌液1環(10 μL),劃線XLD、BS和HE平板。BS平板和XLD平板置于(36±1)℃培養48 h,HE平板置于(36±1)℃培養24 h。

1.4 生化試驗

從XLD平板上挑取中心為黑色、周邊為無色透明環的菌落;從BS平板上挑取棕褐色、灰色或黑色帶金屬光澤的菌落;從HE平板上挑取中心為黑色、周邊為無色或藍綠色的菌落,將挑取的菌落接種三糖鐵瓊脂,先在斜面劃線,再于底層穿刺,最后(36±1)℃培養 24 h。

1.5 鑒定

從三糖鐵瓊脂結果為斜面產堿、底層產酸、產氣、產H2S的斜面上挑取菌落,接種至營養瓊脂并于(36±1)℃培養24 h。對得到的純化單菌落采用全自動微生物生化鑒定系統(VITEK 2,法國生物梅里埃公司)進行菌種鑒定。

1.6 全基因組測序

委托廣州研科生物科技有限公司對全自動微生物生化鑒定結果為沙門氏菌屬的菌落進行基因組DNA的提取、測序、功能基因預測及注釋等工作。

2 結果

2.1 菌種分離及鑒定結果

BPW潤洗液經過18 h培養變渾濁,轉接TTB和SC培養24 h后,培養液也均變渾濁。將TTB與SC增菌液分別接種BS、HE和XLD鑒定培養基,培養結果呈現不同特征。其中,BS瓊脂中的菌落為黑色有金屬光澤,菌落周圍培養基呈黑色;HE瓊脂中的菌落呈藍綠色,帶黑色中心;XLD瓊脂中的菌落呈粉紅色,帶黑色中心。將3種培養基中鑒定出的菌落進一步接種三糖鐵瓊脂,結果顯示:斜面產堿,底層產酸,產H2S,產氣(圖1)。FC10727經全自動微生物生化鑒定系統鑒定為沙門氏菌屬。

圖1 FC10727在BS、HE、XLD與TSI培養基上的形態特征Fig.1 Morphological characteristics of FC10727 on BS,HE,XLD and TSI media

2.2 FC10727基因組序列的基本信息

通過Illumina HiSeq 4000平臺測序,組裝結果表明,FC10727基因組大小為4 638 420 bp,預測有4 016個基因,GC含量為54.15%,總長度為3 849 972 bp,平均長度為788 448 bp,占基因組全長的83%。另外,tRNA預測數有74個,5S rRNA有4個,16S rRNA有1個,sRNA有131個。繪制FC10727的全基因組圖譜,結果如圖2所示。

圖2 FC10727全基因組圖譜最外圈是基因組序列位置坐標,由外到里,分別是編碼基因,COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)、KOG(clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes)、eggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、GO(Gene Ontology)數據庫基因功能注釋信息,非編碼 RNA(noncoding RNA,ncRNA),基因組GC含量,基因組GC skew值分布。Fig.2 Genomic map of the Salmonella strain FC10727The outermost circle is the position coordinates of the genome sequence.From outside to inside,they are coding genes,Cluster of Orthologous Groups of proteins(COG),clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes(KOG),evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups(eggNOG),Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG),Gene Ontology(GO)database gene function annotation information,non-coding RNA(ncRNA),genome GC content,and genome GC skew value distribution.

將基因組測序結果提交NCBI數據庫進行比對,比對結果顯示第1位是腸道沙門氏菌。沙門氏菌屬包括腸道沙門氏菌和邦戈沙門氏菌兩類,其中腸道沙門氏菌廣泛存在于豬、牛、羊、家禽、鳥類、鼠類等多種動物的腸道和內臟中,是世界各國分離率最高的菌型之一。該菌能引起各種家禽和哺乳動物的傳染病,也可引起人類感染,具有重要的公共衛生意義。許多家禽(雞、鴨、鴿等)、家畜(豬、牛、羊、馬、狗、貓等)、鼠類和飛鳥的腸道中儲存有這種細菌,所以家禽、家畜、鼠類、病人和帶菌者是主要的傳染源。

2.3 FC10727基因組的GO預測分析

將FC10727基因組序列提交至GO數據庫進行比對,結果顯示與其對應的基因共2 901個。將這些基因信息依據GO分類標準進行分類,可分為分子功能、細胞組分、生物過程3大類,42小類。

分子功能類基因包括:抗氧化活性、結合、催化活性、通道調節活性、酶活調節活性、分子變換活性、核酸結合翻譯活性、蛋白質結合翻譯活性、分子結構活性、轉運活性等相關基因,共10小類,其中結合與催化活性相關基因最多,均超過1 000個;細胞組分類基因包括:細胞、細胞組分、細胞外區域、大分子復合物、膜封閉腔、細胞器、病毒體等相關基因,共10小類,其中細胞與細胞組分基因最多,有1 064個;生物過程類基因包括:生物黏附、生物調節、細胞成分組織與生物發生、細胞過程、死亡、發育過程、細胞定位與建立、免疫系統過程、定位、運動、代謝過程、多組織過程、多細胞生物過程、生物過程負調控、氮利用、積極調控生物過程、生物過程調節、復制、復制過程、應激反應、信號系統、病毒繁殖等相關基因,共22小類,其中細胞過程與代謝過程基因最多,均超過1 500個(圖 3)。

圖3 FC10727基因在GO數據庫的分類左圖為基因數量;右圖為基因功能,可分為分子功能、細胞組分、生物過程3大類。Fig.3 GO classification for the Salmonella strain FC10727 genesThe left picture shows the number of functional genes,and the right picture shows the prediction of gene functions,which is divided into three categories:molecular function,cellular component,and biological process.

2.4 FC10727基因組的KEGG預測分析

通過比對KEGG數據庫發現,FC10727基因組中與其對應的基因共2 981個,按功能可分為細胞過程、環境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、代謝、生物系統6大類,包含24小類代謝通路,分別對應不同基因序列表達產物。

細胞過程類基因涉及運輸和分解代謝系統、細胞運動系統、細胞生長與死亡3小類,其中細胞運動系統基因最多,共34個;環境信息處理類基因涉及信號轉導和膜轉運兩小類,基因數均超過100個;遺傳信息處理類基因涉及翻譯、復制和修復以及折疊、分類和降解3小類,其中翻譯類基因最多,共80個;人類疾病類基因涉及傳染性疾病、免疫疾病、耐藥性3小類,其中傳染性疾病基因最多,共31個;代謝類基因涉及異生物素的生物降解和代謝、核苷酸代謝、萜類和聚酮化合物的代謝、其他氨基酸代謝、輔助因子和維生素的代謝、脂質代謝、聚糖的生物合成與代謝、能量代謝、碳水化合物代謝、其他次級代謝產物的生物合成、氨基酸代謝,共11小類,其中碳水化合物代謝基因最多,共295個;生物系統類基因涉及內分泌系統和消化系統兩小類,各1個基因(圖4)。

圖4 FC10727基因的KEGG代謝通路分類左圖為基因功能,可分為細胞過程、環境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、代謝、生物系統6大類;右圖為基因數量。Fig.4 KEGG pathway classification for the Salmonella strain FC10727 genesThe left picture shows the prediction of functional genes,which can be divided into six categories:cellular processes,environmental information processing,genetic information processing,human diseases,metabolism,and organismal systems.The right picture shows the number of corresponding functional genes.

2.5 FC10727基因組的eggNOG預測分析

將FC10727基因組與eggNOG數據庫進行比對,得到與其相關的基因共944個。將這些基因信息依據GO分類標準進行分類,共有20類。

代謝類基因共252個,涉及氨基酸運輸與代謝、核苷酸運輸與代謝、碳水化合物運輸與代謝、脂質運輸與代謝、輔酶運輸與代謝以及轉運、分解代謝與次生代謝產物的生物合成;細胞功能類基因共95個,涉及細胞周期控制、細胞分裂、染色體分區、細胞壁/膜/包膜生物發生與細胞運動;分子功能基因共243個,涉及翻譯、核糖體結構和生物發生、轉錄、復制、重組和修復、翻譯后修飾、蛋白質轉換和分子伴侶;運輸與信號轉導功能基因共123個,涉及無機離子的運輸與代謝、信號轉導機制、細胞內運輸、分泌和囊泡運輸。此外,其他類型的基因有能量生成與轉化基因91個、防御機制基因12個、未知功能基因174個等(圖5)。

圖5 FC10727基因在eggNOG數據庫的分類左圖為基因數量;右圖為基因功能,可分為20類,主要與氨基酸運輸與代謝、能量生成與轉化、無機離子的運輸與代謝、碳水化合物運輸與代謝等生物功能有關。Fig.5 eggNOG classification for the Salmonella strain FC10727 genesThe left picture shows the number of corresponding functional genes,and the right picture shows the prediction of functional genes,which can be divided into 20 categories.They are mainly related to amino acid transport and metabolism,energy production and conversion,inorganic ion transport and metabolism,and carbohydrate transport and metabolism,etc.

2.6 FC10727基因組的CAZy預測分析

FC10727基因組與CAZy數據庫的比對結果顯示,與其相關的基因共96個。依據CAZy分類標準進行分類,FC10727基因組可被劃分為5類,其中,碳水化合物結合結構域(carbohydrate binding domain,CBM)類共18個基因;碳水化合物酯酶(carbohydrate esterase,CE)類共4個基因;糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)類共41個基因;糖基轉移酶(glycosyltransferase,GT)類共34個基因;氧化還原酶(oxidoreductase,AA)類共1個基因;不存在多糖裂解酶(polysaccharide lyase,PL)相關基因。

2.7 FC10727耐藥性基因的預測分析

為了深入了解FC10727的耐藥機制,進一步分析耐藥基因功能,發現14個功能基因與抗生素耐藥性相關。其中8個基因與β-內酰胺類抗生素耐藥性相關,包括 sei:SPC_0458、stt:t2384、set:SEN3224、sei:SPC_3260、kpe:KPK_1516、see:SNSL254_A2451、sei:SPC_1000 和 spe:Spro_3259,涵蓋外膜孔蛋白基因3個、外膜通道蛋白基因1個、膜融合蛋白基因2個、β-內酰胺酶基因1個。sei:SPC_0458具有β-內酰胺酶感應信號傳感器AmpG的功能,屬于調節基因;stt:t2384與set:SEN-3224編碼的蛋白質屬于膜融合蛋白acrA;sei:SPC_3260編碼的蛋白質屬于外膜通道蛋白TolC;kpe:KPK_1516與see:SNSL254_A2451編碼的蛋白質屬于外膜孔蛋白ompC;sei:SPC_1000編碼的蛋白質屬于外膜孔蛋白ompF;spe:Spro_3259編碼的蛋白質屬于β-內酰胺酶。另外,1個基因(sew:SeSA_A1717)與萬古霉素耐藥性有關,其編碼的蛋白質屬于D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽酶;1個基因可表達位于沙門氏菌細胞外膜的酰基轉移酶PagP;4個基因的編碼產物分別對應厭氧型一氧化氮還原酶norV、一氧化氮還原酶FoRd-AND(+)norW、厭氧型一氧化氮還原酶轉錄調節因子norR和Rrf2家族轉錄調節因子nsrR,主要起到還原一氧化氮的作用。

2.8 FC10727致病基因的預測分析

為了深入了解FC10727的致病機制,進一步分析致病基因功能,發現27個功能基因與沙門氏菌致病性相關,其中1個基因(seh:SeHA_C3828)與免疫系統疾病有關,可引起系統性紅斑狼瘡;26個基因與傳染性疾病有關。在26個傳染性疾病相關基因中,8個基因與沙門氏菌侵襲上皮細胞相關:invasin A、invasin B、invasin C 和invasin D 4個基因起到侵襲素的作用;sopD和sptP的編碼產物分泌效應蛋白,在入侵真核細胞中起協同作用;yeeJ起到黏附素的作用,介導沙門氏菌對宿主細胞的黏附;sopB編碼的磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸4-磷酸酶是一種肌醇磷酸酶,在發病機理中起到重要作用。相似性分析顯示,invasin A、invasin B、invasin C、invasin D 及 sopB 與志賀氏菌致病基因高度相似。另外,本研究發現4種Ⅰ型菌毛蛋白基因fimA在細菌和宿主細胞的相互作用中發揮重要毒力作用;6種OmpD基因可表達外膜引入蛋白,參與巨噬細胞和腸上皮細胞對細菌的識別;1個ipaH9.8基因存在于侵襲性大質粒,其基因產物為效應分子,與志賀氏菌致病基因高度相似。

3 討論

隨著全基因組測序技術在國內外的迅速發展,生物信息學成為研究致病菌基因組整體功能特別是致病性、耐藥性的重要手段。本研究對從新鮮雞肉中分離出的一株沙門氏菌FC10727進行了全基因組測序,并將基因組信息提交至eggNOG數據庫、KEGG數據庫、GO數據庫以及CAZy數據庫進行匹配,對參與合成和代謝過程(如細胞膜合成、能量轉化產生、轉錄、碳水化合物及氨基酸運輸等)的基因進行了預測與分析,重點對致病基因及耐藥基因進行了分析。

研究發現,FC10727可能有多種耐藥機制。首先,基于β-內酰胺類抗生素耐藥基因的分析,可知FC10727通過多種基因或蛋白質協同作用獲得β-內酰胺類抗生素耐藥性,可能的機制有以下幾種:一是β-內酰胺酶使易感抗生素水解而滅活;二是β-內酰胺酶與抗生素迅速、牢固結合,使其停留于胞膜外間隙中,不能進入靶位,從而產生耐藥性;三是細菌接觸抗菌藥物后,發生外膜孔蛋白ompC和ompF的表達基因失活,造成孔蛋白丟失或嚴重減少,最終導致β-內酰胺類藥物進入菌體內減少,切斷β-內酰胺類藥物輸入細菌體內的途徑,以產生耐藥性;四是主動外排系統,膜融合蛋白acrA捕獲抗菌藥物后,通過外膜通道蛋白TolC,將抗菌藥物運轉至外界[5]。其次,基于萬古霉素耐藥基因的分析,預測FC10727可能通過D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽酶,將細胞壁中合成的D-丙氨酰-D-丙氨酸水解,導致細胞壁前質末端的二肽發生結構性變化,從而降低萬古霉素藥物分子跟細菌細胞壁前質的結合力,以獲得對萬古霉素的耐藥性[6]。再者,基于?；D移酶基因PagP的分析,預測FC10727可表達位于沙門氏菌細胞外膜的?；D移酶PagP,并能將磷脂的C16碳脂肪酸鏈轉移到內毒素分子的脂肪酸鏈上,形成次級脂肪酸鏈,PagP產生的內毒素可以干擾Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)的識別,使沙門氏菌對陽離子抗菌肽產生抗性[7]。最后,基于一氧化氮還原酶基因norV和norW以及一氧化氮還原酶轉錄調節因子編碼基因norR和nsrR的分析,預測沙門氏菌可通過還原一氧化氮,實現對一氧化氮的脫毒,導致吞噬細胞無法殺死沙門氏菌[8]。

沙門氏菌是腸道致病菌,其發病機理是菌體攝入機體后,通過胃進入腸道,抵抗腸道蠕動,黏附并定殖到腸道內,呈分子內寄生,釋放或不釋放腸毒素,引起組織病理損傷。通過對沙門氏菌致病基因的預測可知,FC10727含有多種毒力因子,包括侵襲因子、效應蛋白、黏附素、肌醇磷酸酶、菌毛蛋白、外膜引入蛋白和效應分子,它們通過協同作用,產生綜合毒力。其中,侵襲因子invasin A位于致病島SPI-1,決定細菌進入宿主上皮細胞的能力,是沙門氏菌致病的關鍵性毒力因子;效應蛋白sopD和sptP在細菌入侵真核細胞中起協同作用;yeeJ起到黏附素的作用,對沙門氏菌的定植起著重要的作用,在化學性質方面,黏附素可能為沙門氏菌表面某種特定的蛋白質結構或糖脂成分[9～12];肌醇磷酸酶sopB在發病機理中起到重要作用;菌毛在細菌和宿主細胞的相互作用中發揮重要毒力作用,文中預測的4種Ⅰ型菌毛蛋白fimA可特異性介導細菌對骨髓源樹突狀細胞的黏附和侵襲作用;6種外膜引入蛋白OmpD參與巨噬細胞和腸上皮細胞對細菌的識別,有研究表明OmpD突變菌株的毒力與野生菌株相比明顯降低[13];ipaH9.8的編碼產物作為效應分子,可以阻止血小板吸附到創面內皮下,還可調節宿主對沙門氏菌的反應,如抑制正常凝集作用的形成,并且促使水腫的形成[14～15]。同時,FC10727菌株中還發現了seh:SeHA_C3828基因,該基因能引起人類免疫系統疾病,如系統性紅斑狼瘡,這從基因層面證實個別沙門氏菌可引起系統性紅斑狼瘡。另外,我們發現,5個細菌侵襲上皮細胞基因(sew:SeSA_A1155、spq:SPAB_03584、sea:SeAg_B3007、spq:SPAB_03587、seg:SG2785)與志賀氏菌致病基因相似度高;3個上皮細胞信號轉導基因(seh:SeHA_C1782、spq:SPAB_04085、sei:SPC_1568)與幽門螺桿菌感染基因相似度高,這從基因層面證實致病基因可在各菌種之間傳遞,從而使其獲得致病性。

總的來講,本研究對FC10727進行全基因組分析,預測致病基因和耐藥基因等重要遺傳信息,豐富了沙門氏菌的基因組數據庫。在基因層面,本研究闡明了沙門氏菌可能存在的致病基因與致病機制,提示了沙門氏菌潛在的致病風險,為相關疾病的致病機理研究提供了方向,為相關疾病的疫苗開發和藥物研發提供了分子基礎。另外,該菌株多個耐藥基因、多種耐藥機制的發現,說明養殖戶在家禽家畜的養殖期間可能存在濫用抗生素的情況,這客觀上造成對沙門氏菌的多輪藥物篩選,從而加快了高耐藥性毒株的產生,因此,農業生產監管部門應加大抗生素使用危害的宣傳力度,加強對養殖戶抗生素使用的監管力度,從源頭減少抗生素的使用,降低對抗生素的依賴。從食品安全角度分析,本研究在長沙市生鮮市場隨機采集生鮮雞肉即可檢出沙門氏菌,說明生鮮雞肉在養殖、屠宰、運輸或銷售等環節存在沙門氏菌污染的風險。雖然我國傳統飲食習慣是不直接食用生鮮雞肉,但普通消費者對于致病菌污染并無防范意識,這使致病菌存在較大程度的暴露風險,如:處理生鮮果蔬與生鮮畜禽肉的廚具混用;處理生食與熟食的廚具混用,這都會造成不可避免的交叉污染,導致普通消費者攝入沙門氏菌,引起腹瀉、嘔吐等疾病。本研究提示,消費者要提高生鮮畜禽肉中包括沙門氏菌及其他致病菌如志賀氏菌、致瀉性大腸桿菌等的防范意識,不食用未充分加熱的畜禽肉制品。同時,對于生鮮畜禽肉以及生鮮雞蛋等沙門氏菌污染可能性較高的食品,目前我國并未制定致病菌限量標準,也未有關于生鮮食品中致病菌食品安全監督檢驗的相關報告,因此一定程度上存在食品安全監管盲區。本研究提示,食品安全監管部門應根據致病菌污染風險等級制定生鮮畜禽肉或其他生鮮食品的相關國家標準,并開展各地各類生鮮食品的致病菌監督抽檢與風險評估工作,加強監督,倒逼生鮮畜禽肉和其他生鮮食品生產與銷售企業,使其優化工藝、提高質量、防范風險,最終保障食品安全。