固相萃取-UPLC-MS/MS同時測定水中16種磺胺類抗生素殘留

王運儒 孟祥至 秦玉燕 鄧有展

摘 要：建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜（SPE-UPLC-MS /MS）同時檢測水中16種磺胺類抗生素的分析方法。水中的磺胺類抗生素經 HLB凈化柱富集純化后經Acquity UPLC HSS T3 柱分離，多反應監測模式（ MRM） 進行定性定量分析。流動相由乙腈和0.1 %的甲酸水溶液（V/V）組成，梯度洗脫。該方法的檢出限：1.0～5.0 μg/kg;加標回收率范圍：78.6 %～103.2 %;相對標準偏差范圍：1.1 %～12.8 %。結果表明，該方法靈敏度高、具有良好的精密度和準確度，適用于水中 16 種磺胺類藥物殘留檢測。

關鍵詞：磺胺類抗生素 固相萃取 超高效液相色譜串聯質譜法

中圖分類號：TS201.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A

Determination of 16 Kinds of Sulfonamides Residues in Water by Solid Phase Extraction-UPLC-MS/MS

WANG Yunru1，2，3*， MENG Xiangzhi4，QIN Yuyan1，2，3*，DENG Youzhan1，2，3

（1Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning， Guangxi 530001， China;2 Laboratory of Quality Risk Assessment for Agro-products （Nanning） Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Nanning， Guangxi 530001， China;3 Quality Supervision and Testing Center of Subtropical Fruit and Vegetable，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Nanning， Guangxi 530001， China;4 Shandong Benyuan Environmental Technology Co. Ltd.，Jinan， Shandong 250100， China）

Abstract： A method was developed for simultaneous determination of 16 sulfonamides antibiotics in surface water by solid-phase extraction with ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（SPE-UPLC-MS/MS）. The sulfonamides in water was enriched and purified by HLB solid phase extraction column， and separated by Acquity UPLC HSS T3 column with a gradient elution of acetonitrile and 0. 1% formic acid （v：v）， then the qualitative and quantitative analysis was performed under the multiple reaction monitoring（MRM） mode. The detection limit was 1.0～5.0 μg/kg， recovery rate was 78.6%～103.2% and the relative standard deviations was 1.1%～12.8%. The method with high sensitivity， good precision and accuracy is suitable for detection of 16 sulfonamides residues in water.

Key words： Sulfonamide antibiotics; solid phase extraction; ultra high performance liquid chromatography tandem mass

磺胺類抗生素藥物（Sulfonamides，SAs）是我國目前應用最多，使用量最大的抗生素之一，具有抗菌譜廣、低成本、高穩定性和較強的親水性等特征[1-3]。磺胺類抗生素通過干擾細菌的葉酸合成從而使細菌生長和繁殖受到抑制，被廣泛用于醫療、畜牧業和水產養殖業等，屬于少有的人類、畜牧和水產養殖業共同使用的藥物。據統計，在2013年，SAs 在我國的使用量達到了7920 t，其中用于獸藥的占76 %，用于醫藥的占11 %[4]。目前磺胺類抗生素污染的來源主要是藥物生產過程中排放的廢水、水產養殖業、畜牧業和人類醫療用藥。磺胺類抗生素因具有很高的穩定性，在環境中降解速度慢，人畜服用后磺胺類藥物后大部分在體內沒有代謝就直接以原藥的形式排入環境中，會長時間殘留在土壤環境和水環境中，嚴重影響人類的健康[5-6]。因此，近幾年來磺胺類抗生素的濫用造成的環境污染和風險隱患，成為了研究的熱點。

目前磺胺類抗生素的殘留檢測方法有高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC） [7]、紫外可見分光光度法（Ultraviolet–Visible spectroscopy，UV-Vis） [8]、毛細管電泳法（ Capillary Electrophoresis，CE） [9-10]、電化學法[11-12]、酶聯免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[13]、熒光偏振免疫分析法[14]、高效液相色譜-串聯質譜聯用（High performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[15-17]等。現有的檢測方法如ELISA方法特異性不高無法準確定性、檢測復雜基質時可能出現假陽性;高效液相色譜法存在分離度不好，定性困難的缺點。超高效液相色譜-串聯質譜法（Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ，UPLC-MS/MS）因分析效率高、靈敏度高等優勢，成為抗生素殘留分析的主流檢測方法。已有的檢測方法存在操作繁瑣、耗時較長、檢測抗生素種類或數量相對較少、不適于水樣品快速篩查分析等缺點。

為了實現快速、準確的對水中殘留的磺胺類抗生素進行了分析檢測，本研究以Oasis HLB固相萃取柱富集和凈化，UPLC-MS/MS測定水中16種磺胺類抗生素的殘留，為水中抗生素的快速篩查提供參考。

磺胺類抗生素結構通式：

圖1 磺胺類抗生素結構通式

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：UPLC（LC-20AD）超高壓液相色譜儀（日本島津公司）; API3200 質譜儀（美國AB公司）;T18高速均質儀（德國IKA公司）;純水儀（上海洋淪精密設備科技有限公司）;小型旋渦混勻儀（德國IKA公司）;色譜柱為島津Shim-pack XR-ODSⅡ（2.0 ×75 mm;2.2 μm）、Waters Acquity UPLC TSS T3色譜柱（100 ×2.1 mm，1.8 μm）。

試劑：乙腈（色譜級），德國默克公司;蒸餾水（娃哈哈純凈水）;固相萃取柱C18（Agela，3 mL/50 mg），HLB（Waters Oasis，3 mL/50 mg），標準品混合液（濃度100 mg/kg）由上海安譜實驗科技股份有限公司。固相萃取小柱C18（500 mg/6 mL， Aglient）， Oasis HLB（500 mg/6 cc，Waters）、Bond Elut-SAX（500 mg/6 mL，Aglient）。

1.2 溶液配置

標準品混合液（100 mg/kg）：準確移取質量濃度為100 mg/kg的標準品0.5 mL于 5 mL 容量瓶中，用甲醇定容到5.00 mL，于-20 ℃冰箱避光保存。

標準曲線工作液：用流動相 0.1 %甲酸-乙腈溶液稀釋混合中間液，配制系列標準曲線為 0.005、 0.01、 0.05、 0.10、 0.20、 0.50 mg/L。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品提取

取500 mL采集到的樣品，固相萃取小柱先分別經過10 mL甲醇、10 mL水活化后，再將 500 mL水樣上柱后以1 mL/min的流速真空抽干，再以10 mL甲醇洗脫，洗脫液用氮氣吹至近干后加入1.0 mL 30 %甲醇溶液定容，過0.22 μm有機濾膜，超高壓液相色譜—串聯質譜測定。

1.3.2 檢測條件

液相色譜條件：流動相由乙腈（A）和0.1 %的甲酸水溶液（V/V）（B）組成，梯度洗脫程序為：0～0.01 min，98 %A;0.01～5.0 min，98 %A～15 %A;5.0～8.5 min，15 %A;8.5～9.0 min，15 %A～98 %A;9.0～13.0 min，98 %A。柱溫40 ℃，進樣量5 μL，整個分析時間為13.0 min，各化合物保留時間見表1。

質譜條件：電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI），采用正離子多反應監測（Multiple reaction monitoring，MRM）掃描模式采集數據。以全掃描、子離子掃描等方式優化每種化合物母離子和子離子的強度。優化后的質譜分析條件：電噴霧電壓（IS）5500.0 V，離子源溫度（TEM）550℃，氣簾氣壓力（ CUR ） 55 psi，霧化氣壓力（Gas 1）55 psi，加熱氣（Gas 2） 55 psi。16種磺胺類抗生素的母離子及子離子見表1。

2 結果與討論

2.1 質譜與色譜條件的優化

根據16種磺胺類抗生素的性質，配制濃度為 1.0 mg/L的混合標準溶液，選擇正離子模式掃描，對目標化合物在合適的掃描范圍內進行一級質譜掃描，選定各個化合物的母離子，通過優化去簇電壓、碰撞能、噴霧電壓、離子源溫度等因素，選取2個離子豐度高及穩定性好的特征碎片離子分別作為定量離子和定性離子。16種磺胺類抗生素種有2對同分異構體化合物，分別是母離子為281.0的磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對氧嘧啶和磺胺甲氧嗪，母離子為311.0的磺胺鄰二甲氧嘧啶和磺胺間二甲氧嘧啶。通過對色譜流動相的優化，可以將其完全分開，總離子色譜圖見圖2。

比較了Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）和島津Shim-pack XR-ODSⅡ（2.0 mm×75 mm，2.2 μm）對16種抗生素的分離效果。結果顯示，經Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱分離后16 種抗生素的峰形相對尖銳。這是由于HSS T3柱填充物是硅膠基質，采用的是低密度封端技術，它不僅能保留和分離水溶性的極性小分子有機化合物，而且還能提供了更寬的pH值操作范圍，對于同時分析多種目標物的效果相對較佳，各化合物色譜圖見圖3。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 凈化柱的優化

比較了C18（500 mg/6 mL，Aglient）、Oasis HLB（500 mg/6cc，Waters）和Bond Elut-SAX（500 mg/6 mL，Aglient）3種固相萃取小柱對抗生素混合物的凈化效果。結果表明Oasis HLB凈化柱對目標化合物的凈化回收效果明顯好于其他2種凈化柱（見圖4）。可能由于Waters Oasis HLB吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮2種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，其保留機理為通過一個“特殊的極性捕獲基團”來增加對極性物質的保留從而提供很好的水浸潤性，即使凈化柱柱床干涸，回收率也不受影響。

2.2.2 線性范圍、檢出限

根據每種抗生素的響應值，配制系列質量濃度的空白樣品基質匹配標準溶液，在最佳條件下進行測定，以目標物定量離子的峰面積（Y）為縱坐標，對應質量濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，外標法定量。逐級稀釋混合標準溶液，分別以信噪比（S/N）為3所對應的濃度作為本方法的檢出限（LOD），方法的線性范圍、LOD 結果見表2。結果顯示，16種目標抗生素在各自線性范圍內呈良好的線性關系，相關系數（R2）均大于0.99，LOD 為1.0～5.0 μg/kg。

2.2.3 回收率及精密度

在空白水樣品中分別添加 5.0、20.0、100.0 μg/kg 3個水平的混合標準溶液，按照相同方法處理后進行UPLC- MS/MS測定，每個水平重復測定5次，計算回收率及相對標準偏差（RSD）。

3 結論

本試驗建立了水中16種磺胺類抗生素殘留的檢測方法。樣品直接采用HLB固相萃取提取，以0.1 %甲酸溶液和乙腈作為流動相，經UPLC-MS/MS測定。該方法靈敏度高、分離度好，操作簡單，以固相萃取技術富集水樣品，實現了水樣處理的自動化，可用于水樣環境中磺胺類抗生素的快速測定，為水環境中的污染物快速檢測提供技術依據。

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