養雞場混合感染的分離鑒定與藥敏試驗

文│李佳璇 宋祥軍（安徽農業大學動物科技學院）

王苗利 藺曉月 陳靜 孫圣福（山東省動物疫病預防與控制中心）

鄒本革（青島農業大學海都學院）

近年來，隨著養雞業規模化、集約化的發展，以及飼養管理不當，使得養殖場常發生兩種或兩種以上病原體的混合感染。雞大腸桿菌常與其他細菌、病毒等病原體混合或繼發感染，蛋雞和肉雞更易發病，生殖系統炎癥對于蛋雞養殖危害較為嚴重。如某養雞場因飼養管理不當，雞群抵抗力下降，引起大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的混合感染，導致蛋雞發病死亡，經濟損失慘重。當多種病原體混合感染時，單一用藥或使用抗生素可能達不到理想的治療效果，還會大大增加臨床診斷及治療的難度，嚴重危害養雞業的發展。為了避免病情加重，產生耐藥菌株等不良后果，可采取聯合用藥或幾組敏感藥物交替使用的方法來治療多種病原體的混合感染。

金黃色葡萄球菌（SA），屬于葡萄球菌屬革蘭氏陽性菌，是一種常見的食源性致病微生物，常引起化膿性疾病、敗血癥等。雞感染SA后會引起敗血癥和病理變化，雛雞多表現為急性，青年雞表現為急性或慢性，成年雞表現為慢性，感染后死亡率最高的是雛雞。大腸桿菌屬腸桿菌科、埃希菌屬，有菌毛、莢膜和微莢膜，是革蘭氏陰性短桿菌，有鞭毛，可運動。禽致病性大腸桿菌（APEC）能引起肉雞的心包炎、肺泡炎、肝周炎及敗血癥；蛋雞出現輸卵管炎和敗血癥，導致蛋雞死亡率上升，產蛋率下降。

隨著我國養殖業不斷發展壯大，抗生素的使用成了畜禽養殖過程中不可或缺的環節，但是抗生素的使用并沒有得到有效的監管，許多散養戶在沒有獸醫的指導下隨意使用抗生素，不僅達不到治療效果，反而會出現其他不良癥狀。通過實驗室對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進行鑒定和藥敏分析，可以指導正確的臨床用藥，確定其敏感藥物，對防止抗生素濫用以及產生細菌耐藥性具有重大意義，為臨床治療金黃色葡萄球菌病和大腸桿菌病混合感染提供科學依據。

一、材料與方法

1.材料。

（1）主要儀器設備。梅里埃生化及藥敏儀VITECⅡcompact60，奧林巴斯顯微鏡，羅氏自動核酸提取儀，羅氏熒光定量PCR儀，生物安全柜，移液器（0～300微升）。

（2）主要試劑盒。禽傳染性支氣管炎病毒（AIBV）核酸檢測試劑盒，購自廣州伯鑫生物科技有限公司；禽流感病毒熒光PCR檢測試劑盒，購自北京森康生物技術開發有限公司；雞傳染性新城疫病毒熒光RTPCR檢測試劑盒，購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。

（3）主要試劑材料。科馬嘉顯色培養基，梅里埃藥敏分析卡，革蘭氏染色液，0.45%氯化鈉溶液，營養瓊脂，0.01M的PBS緩沖液（pH7.2）。

◎圖1 新城疫病毒RT-PCR擴增圖像

◎圖2 傳染性支氣管炎病毒RT-PCR擴增圖像

◎圖3 禽流感病毒RT-PCR擴增圖像

2.試驗方法。

（1）發病情況調查。調查了山東省濟南市章丘區某養殖場蛋雞發病情況，調查內容包括該養殖場雞存欄量、死亡數量、發病日齡、臨床癥狀、免疫和用藥情況以及剖檢情況，并對該養殖場飼養環境、消毒情況進行記錄。

（2）病毒檢測。采取5只病死雞肝，分別研磨，制成混懸液，離心。按照試劑盒使用說明進行熒光RTPCR擴增。

（3）細菌分離鑒定及藥敏分析。一是病料接種培養。選取病料病變交界處的區域，在顯色培養基上劃線接種，將培養基倒置，放于37℃溫箱培養24小時。二是細菌染色鏡檢。將細菌固定在潔凈玻片上，采用革蘭氏染色法將細菌染色。在100倍油鏡下觀察染色結果。三是細菌分離純化。挑取顯色培養基上的單個菌落，在營養瓊脂平板上劃線接種，37℃恒溫純化培養24小時。四是細菌16S rRNA鑒定及繪制進化樹。進行16S rRNA測序，并使用生物信息學MEGA6.0軟件，繪制進化樹。五是細菌藥敏分析。挑取純化好的單菌落，在氯化鈉溶液中混勻，制備成菌懸液，插入藥敏分析卡，待18小時后讀取結果。

二、結果與分析

1.發病情況調查結果。該養殖場存欄雞4000只，主要是蛋雞發病死亡。病雞的糞便正常，無呼吸道及其他癥狀，基本上是突然死亡。該養殖場在發病后使用慶大霉素進行治療，但并未達到治療效果。解剖發現，病死雞肝輕微腫大且易碎，心肌內膜出血。實地調查后發現，該養殖場生物安全防控不到位，飼養環境較差，沒有及時清理糞便，通風較差，雞舍消毒不徹底，對飼養人員管理不嚴格。

2.病毒檢測結果。

（1）新城疫病毒檢測結果。雞新城疫病毒RT-PCR結果見表1，新城疫病毒RT-PCR擴增圖像見圖1。由表1可知，本次測定的5份樣品核酸的CT值＞40，無陽性結果；由圖1可知，其擴增曲線為一條直線，與陰性對照相符，新城疫病毒檢測結果為陰性，因此該養殖場的蛋雞并非新城疫病毒感染。

表1 雞新城疫病毒RT-PCR結果判定

（2）傳染性支氣管炎病毒檢測結果。傳染性支氣管炎病毒RT-PCR結果見表2，傳染性支氣管炎病毒RTPCR擴增圖像見圖2。由表2可知，本次測定的樣品核酸無CT值；由圖2可知，其擴增曲線為一條直線，與陰性對照相符，傳染性支氣管炎病毒檢測結果為陰性，說明該養殖場的蛋雞并非傳染性支氣管炎病毒感染。

表2 傳染性支氣管炎病毒RT-PCR結果判定

（3）禽流感病毒檢測結果。禽流感病毒RT-PCR結果見表3，禽流感病毒RT-PCR擴增圖像見圖3。由表3可知，本次測定的樣品核酸無CT值；由圖3可知，其擴增曲線為直線，與陰性對照相符，禽流感病毒檢測結果為陰性，表明該養殖場的蛋雞并非禽流感病毒感染。

表3 禽流感病毒RT-PCR結果判定

3.細菌分離鑒定及藥敏分析結果。

（1）病料接種結果。顯色培養結果見圖4～8。由圖可知，培養基上生長出兩種不同顏色的菌落，分別為黃色菌落和紫色菌落。

（2） 染色鏡檢結果。染色鏡檢結果見圖9和圖10。由圖9可知，黃色菌落為革蘭氏陽性球菌，呈藍紫色、葡萄串樣；由圖10可知，紫色菌落為革蘭氏陰性短桿菌，呈紅色、棒狀。

（3）分離純化結果。兩種細菌純化效果良好，無雜菌生長。

◎圖9 金黃色葡萄球菌革蘭氏染色情況

◎圖10 大腸桿菌革蘭氏染色情況

（4）16S測序及繪制進化樹結果。

16S測序結果。16S的測序鑒定結果見表4。由表4可知，菌種1與大腸桿菌的同源性為99.36%，菌種2與金黃色葡萄球菌的同源性為100%。

表4 兩種菌的16S鑒定結果

進化樹繪制。進化樹見圖11。對1809007A和1809007B分離菌株的16S片段采用生物信息學MEGA6.0軟件，選擇NJ（Neighbor-Joining，鄰接法）、Kimura 2-parameter（Kimura-2參數）模型和Bootstrap 1000，構建遺傳進化樹，進行遺傳進化分析。其中，紅色三角標注的為分離菌株。由進化樹可以看出，1809007A菌株與Escherichia coli 16S ribosomal RNA，J01859.1和Escherichia coli strain NBRC102203NR_114042.1 菌株同源性較高，處于同一分支，同源性為99.6%，推斷1809007A為大腸桿菌菌株。1809007B菌株與Staphylococcus aureus strain ATCC 12600 NR_115606.1和Staphylococcus aureus subsp. anaerobius strain NR_036828.1同源性較高，同源性為100%，推斷1809007B為金黃色葡萄球菌。

◎圖4～8 分別為病料1～5的顯色培養結果

（5）金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的藥敏結果。純化好的革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌制備成均勻的菌懸液，分別插入藥敏卡，放入梅里埃生化及藥敏儀VITECⅡcompact60中，反應18小時，觀察結果：金黃色葡萄球菌藥敏分析結果見表5，大腸桿菌藥敏分析結果見表6。

表5 金黃色葡萄球菌藥敏分析結果

表6 大腸桿菌藥敏分析結果

根據表5中的MIC值和解釋結果可知，該養殖場金黃色葡萄球菌最為敏感的藥物為氨芐西林（MIC值為0.06）；其次是替加環素、苯唑西林和慶大霉素；環丙沙星、四環素等藥物不敏感。

根據表6中MIC值和解釋結果可知，該養殖場大腸桿菌最敏感的藥物為厄他培南（MIC值≤0.5）和環丙沙星（MIC值為0.5）；其次為亞胺培南和左氧氟沙星；慶大霉素、頭孢類及青霉素類藥物等不敏感。

三、結論與討論

1.結論。該養殖場經實驗室檢測確診為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合感染，金黃色葡萄球菌對氨芐西林敏感，大腸桿菌對厄他培南與環丙沙星敏感。根據喹諾酮類藥物與青霉素類藥物配伍在治療某些細菌病時具有協同作用，因此選用氨芐西林與環丙沙星配合使用，協同增強藥效。在該養殖場混合使用這兩種藥物，取得了良好的治療效果，為臨床上大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合感染提供了合理的治療方案。

◎圖11 大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的進化樹

2.加強飼養管理。近年來，在蛋雞的養殖過程中，病原體混合感染的病例越來越多，給我國養雞業帶來了較大危害。該養殖場雞群被金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合感染，主要原因是該養殖場對于生物安全的重要性認識不夠，雞舍通風不暢，糞便清理不及時，雞舍消毒不徹底，雞舍環境較差，導致雞群免疫力下降，被環境中的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染而患病。大腸桿菌與金黃色葡萄球菌都是條件致病菌，飼養管理不當、不注重生物安全都會增加感染風險，因此建議該養雞場場主加強對生物安全知識的學習，強化養殖場內的飼養管理，加強雞群疫病檢測、防控工作：定期對雞進行預防接種；及時清理糞便，加強衛生消毒，做好雞舍內的衛生工作；注意給雞群做好防寒保暖，適當補充光照；科學飼喂，嚴格控制飼養人員流動。

3.重視實驗室檢測。該養殖場在雞群發病前期根據過往經驗，使用了慶大霉素一種抗生素進行治療。后經實驗室鑒定，發病雞是由金黃色葡萄球菌和大腸桿菌這兩種細菌感染導致的，慶大霉素只對金黃色葡萄球菌敏感，對大腸桿菌并不敏感，因此經過一段時間的用藥不僅未見好轉，反而損失慘重。胡慧等對河南某養雞場感染大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的雛雞進行藥敏試驗，結果是環丙沙星與慶大霉素是這兩種菌的首要敏感藥物，對氨芐西林不敏感。本實驗室通過藥敏分析，篩選出這兩種細菌的敏感藥物是氨芐西林與環丙沙星，與胡慧等的藥敏分析結果不完全一致，因此不可盲目參考其他養殖場的治療方案。由此可知，實驗室檢測對于臨床診斷和治療意義重大，經過實驗室的檢測不僅可以精確診斷出病原微生物，還可以指導科學用藥，大大降低死亡率，減少養殖場戶的經濟損失，對我國養雞業的發展具有重要意義。