miR-494和ATF3 mRNA在腦膜瘤組織中的表達關系及意義

王剛，張金仿，張茜，高琰，董益鵬，吳濤

腦膜瘤是臨床較為常見的中樞神經系統腫瘤，部分腦膜瘤因生長部位特殊、侵襲性生長、緊鄰重要組織結構，導致手術不能全切腫瘤，對患者生存狀況造成不利影響[1]。目前，腦膜瘤發病相關機制尚不完全明確，但研究認為其發病與基因變異、環境、顱腦外傷、炎性反應、微小RNA(microRNA，miRNA)等有關[2-3]。miRNA可調控有關靶基因轉錄及表達，其在腦膜瘤中表達異常，miRNA可作為腦膜瘤非侵入性標志物[4]。近期研究顯示，微小RNA-494(miRNA-494，miR-494)在神經膠質瘤患者中表達上調，其可能影響有關信號通路，促進人腦膠質瘤癌細胞增殖、遷移，進而促進癌癥發展[5]。另有研究表明，激活轉錄因子3(activating transcription factor 3，ATF3)在腦膜瘤中呈高表達，ATF3信使RNA(mRNA)表達水平與病理分級呈正相關[6]。但miR-494、ATF3在腦膜瘤患者中的表達水平及其與腦膜瘤臨床特征的關系尚未見相關報道。基于此，現檢測miR-494、ATF3 mRNA在腦膜瘤組織中的表達水平，分析兩者與腦膜瘤臨床特征及預后的關系，以期為早期診療腦膜瘤、評估患者預后提供參考，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年10月—2018年1月于首都醫科大學附屬北京友誼醫院神經外科行腦膜瘤切除患者79例為腦膜瘤組，患者術前均未進行放化療及免疫治療。男33例，女46例，年齡44～69(57.74±9.46)歲，<60歲39例，≥60歲40例；腫瘤部位：顱底34例，非顱底45例；腫瘤直徑：<4 cm 38例，≥4cm 41例；有淋巴結轉移29例，無淋巴結轉移50例；WHO分級[7]：Ⅰ～Ⅱ級51例，Ⅲ級28例；TNM分期[8]：Ⅰ～Ⅱ期42例，Ⅲ～Ⅳ期37例；有家族遺傳史者7例；基礎病：合并糖尿病/高血壓者12例。另取因腦外傷切除腦組織患者79例為對照組，男35例，女44例，年齡45～71(58.04±9.83)歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準(審批號：2013第241號)，患者及家屬知情同意并簽署協議書。

1.2 病例選擇標準 (1)診斷標準：參考“2016年世界衛生組織中樞神經系統腫瘤分類”關于腦膜瘤相關判定標準進行診斷[7]。(2)納入標準：①患者均符合腦膜瘤診斷標準，經病理學確診；②患者生理病理檢查資料均完整；③既往無精神障礙史，可自由溝通和交流。(3)排除標準：①有心源性休克史者；②合并其他惡性腫瘤者；③合并急性炎性反應、血液系統疾病者；④合并心、肝、腎等功能不全者。

1.3 qRT-PCR檢測miR-494、ATF3 mRNA表達 將術中切除且經病理學確診為腦膜瘤組織及對照組正常腦膜組織標本均立即置于液氮罐中，凍存24 h后，移至-80 ℃冰箱中保存，待檢。上述腦膜瘤組織及正常腦膜組織，置于研缽中，加液氮、研碎，加TRIzol試劑(上海杰美基因醫藥科技有限公司)裂解、離心，提取RNA。參考反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix，上海浩然生物技術有限公司)說明書將RNA反轉錄為cDNA。嚴格按照PCR試劑盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix，上海研卉生物科技有限公司)說明書，配制反應體系、qPCR檢測。總反應體系(20 μl)包括：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 8 μl，cDNA 2 μl，正向引物1 μl，反向引物1 μl，dH2O 8 μl。反應條件：95℃預變性45 s，95 ℃ 15 s，60℃ 35 s，40個循環。miR-494以U6為內參，ATF3 mRNA以GAPDH為內參，以2-△△CT法計算miR-494、ATF3 mRNA的表達水平。檢測基因及內參基因引物序列見表1。

表1 miR-494、ATF3 mRNA及對應內參U6、GAPDH的引物序列

1.4 隨訪 對79例腦膜瘤患者以門診或電話隨訪3年，以腦膜瘤患者手術日期為隨訪起點，患者死亡或隨訪至2021年1月31日為隨訪終點。

2 結 果

2.1 2組miR-494、ATF3 mRNA表達水平比較 與對照組比較，腦膜瘤組miR-494、ATF3 mRNA表達水平均顯著升高(P<0.01)，見表2。

表2 2組miR-494、ATF3 mRNA表達水平比較

2.2 腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA表達水平在不同臨床病理特征中比較 以腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA表達水平均值1.65、1.74為界限，≤1.65的患者為miR-494低表達亞組(n=38)，>1.65的患者為miR-494高表達亞組(n=41)，≤1.74的患者為ATF3 mRNA低表達亞組(n=40)，>1.74的患者為ATF3 mRNA高表達亞組(n=39)。結果顯示，腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA低表達亞組有淋巴結轉移、WHO分級Ⅲ級、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者比例低于高表達亞組(P<0.05)，而在不同性別、年齡、部位、腫瘤直徑、有無家族遺傳史、有無基礎病患者中比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA表達水平在腦膜瘤患者不同臨床病理特征中比較 [例(%)]

2.3 腦膜瘤組織miR-494表達與ATF3 mRNA表達的相關性 Pearson相關分析結果表明，腦膜瘤組織中miR-494表達水平與ATF3 mRNA水平呈正相關(r=0.578，P=0.000)。

2.4 腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA表達水平與腦膜瘤患者預后的關系 對79例腦膜瘤患者隨訪36個月，腦膜瘤患者死亡29例，存活50例，總生存率為63.29%。腦膜瘤患者miR-494低表達亞組術后36個月累積生存率為89.47%(34/38)，明顯高于miR-494高表達亞組累積生存率39.02%(16/41)(χ2=21.798，P=0.019)。腦膜瘤患者ATF3 mRNA低表達亞組術后36個月累積生存率為82.50%(33/40)，明顯高于ATF3 mRNA高表達亞組累積生存率43.59%(17/39)(χ2=13.015，P=0.000)。

2.5 COX回歸分析腦膜瘤患者預后的影響因素 以腦膜瘤患者預后為因變量，以上述結果中P<0.05的指標為自變量，納入二分類COX回歸模型，結果顯示，發生淋巴結轉移、TNM分期增加及miR-494、ATF3 mRNA表達水平升高是影響腦膜瘤患者預后的獨立危險因素(P<0.01)，見表4。

表4 COX回歸分析腦膜瘤患者預后的影響因素

3 討 論

惡性腦膜瘤具有高度侵襲性、彌漫性的特點，嚴重影響患者生命健康[9-10]。此外，臨床多采用手術切除、放射治療等手段治療腦膜瘤，但預后較差[11-12]，基因靶向治療雖有望作為臨床治療腦膜瘤的有效手段，但目前仍缺少理想治療靶標，因此，尋找影響腦膜瘤的指標，明確其在腦膜瘤中的發病機制，對改善患者生存質量有一定積極意義。

miRNA是廣泛存在于血液及各大器官組織的小分子RNA，其在免疫調節、機體代謝、信號傳導、細胞凋亡等過程中具有重要調控作用[13-15]。miR-494是miRNA家族成員之一，與缺血缺氧疾病及腫瘤發展有關，其在非小細胞肺癌患者血清中水平明顯上調，miR-494是影響術后復發的危險因素，促進腫瘤發展，其對判斷患者預后有一定潛在價值[16]。另有研究顯示，miR-494在乳腺癌患者中表達失調，其可通過抑制煙酰胺磷酸核糖基轉移酶表達及活性，從而誘導乳腺癌細胞凋亡，降低細胞活力[17]。本研究中腦膜瘤組miR-494表達水平較對照組高，與其在神經膠質瘤中的趨勢一致[5]，提示miR-494可能在腦膜瘤發病進展中發揮重要作用，推測miR-494可能作為促癌因子，通過與靶基因相結合，影響相關信號傳導途徑，促進癌細胞增殖、抑制癌細胞凋亡，從而參與并促進腦膜瘤發展，但具體作用機制如何，需要進一步研究。

ATF3屬于ATF/環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(CREB)亞家族成員，是細胞在神經元或肝損傷、缺血—再灌注損傷、皮膚損傷、DNA損傷或病毒癌基因刺激下產生的一種含亮氨酸拉鏈結構的蛋白質，在基因轉錄、創傷愈合、機體穩態維持、信號傳導、細胞黏附、腫瘤形成、侵襲轉移等生理病理過程中起重要作用[18-19]。研究發現，ATF3在腎上腺皮質腺腫瘤組織及細胞中表達升高，下調ATF3表達可抑制腎上腺皮質腺癌細胞增殖，激活細胞凋亡通路，誘導癌細胞凋亡[20]。另外，ATF3在神經膠質瘤患者中呈過表達，ATF3-siRNA轉染膠質母細胞瘤細胞系U373MG細胞后，細胞增殖活性降低，細胞凋亡比例增加，細胞遷移受到損害，提示ATF3促進人類神經膠質瘤發展[21]。本研究中腦膜瘤組ATF3 mRNA表達水平較對照組高，與馬斯奇等[6]研究結果相符，提示ATF3 mRNA可能與腦膜瘤發病進程相關，究其原因，ATF3 mRNA作為應激早期快速反應基因，經損傷性應激信號誘導后表達，進而影響細胞黏附、信號傳導，抑制細胞凋亡、促進細胞增殖，從而在腫瘤形成與發展中發揮促進作用。

本研究中腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA表達水平與淋巴結轉移、WHO分級、TNM分期有關，進一步提示兩者可能影響腦膜瘤臨床特征，參與腦膜瘤發展進程，推測miR-494、ATF3 mRNA均可能增強癌細胞的浸潤、侵襲，促進腦膜瘤轉移。本研究顯示，腦膜瘤組織miR-494表達水平與ATF3 mRNA水平呈正相關，提示miR-494可能與ATF3 mRNA相互影響，協同促進腦膜瘤發展，推測miR-494、ATF3 mRNA共同調控細胞增殖、凋亡，但具體調控機制需進一步探索。本研究發現，腦膜瘤患者miR-494、ATF3 mRNA低表達亞組術后36個月累積生存率分別高于miR-494、ATF3 mRNA高表達亞組，提示腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA表達升高與不良預后有關，二者有望作為評估腦膜瘤患者預后的標志物。此外，發生淋巴結轉移、TNM分期增加及miR-494、ATF3 mRNA表達水平升高是影響腦膜瘤患者預后的獨立危險因素，檢測miR-494、ATF3 mRNA水平有利于判斷患者預后情況。

綜上所述，腦膜瘤組織miR-494、ATF3 mRNA表達均上調，兩者可能通過相互作用共同參與腦膜瘤發展，檢測兩者水平有助于評估患者預后。但未在動物實驗方面探究miR-494、ATF3 mRNA在腦膜瘤中的作用機制，后續將深入探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

王剛：設計研究方案，課題設計，實施研究過程，論文撰寫；張金仿、張茜：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；高琰：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；董益鵬、吳濤：進行統計學分析