Hippo信號通路核心元件在套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其意義

胡琛婕，閔鳳玲

(揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，江蘇 揚(yáng)州 225009)

0 引言

套細(xì)胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL)是一種以t(11;14)(q13;q32)染色體移位和cyclinD1蛋白過度表達(dá)為主要特征的侵襲性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，異質(zhì)性高且預(yù)后差[1]。Hippo信號通路是一條在進(jìn)化上高度保守的信號通路，可調(diào)控組織器官大小、細(xì)胞增殖及凋亡等，LATS1, LATS2,YAP, TAZ為該通路中公認(rèn)的核心元件，任一元件的異常均有可能導(dǎo)致組織異常增殖，已被證實(shí)對實(shí)體腫瘤及多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有重要作用[2-6]，但在MCL中的研究不多。

近年來，除傳統(tǒng)化療藥物的使用，單克隆抗體利妥昔單抗、免疫調(diào)節(jié)劑來那度胺、蛋白酶體抑制劑硼替佐米(bortezomib, BTZ)、較新的小分子抑制劑伊魯替尼及細(xì)胞治療(如造血干細(xì)胞移植、CAR-T)的臨床應(yīng)用，使得MCL患者的預(yù)后有了很大的改善，但治愈的可能性仍然很小[1,7-10]。BTZ作為首個(gè)用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的蛋白酶體抑制劑，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于多發(fā)性骨髓瘤和復(fù)發(fā)/難治性MCL患者的治療[7,10,11]。地西他濱(decitabine, DAC)為去甲基化藥物(DNA甲基化特異性抑制劑)，在骨髓異常增生綜合征的治療中得到認(rèn)可，但目前給藥方案尚未得到統(tǒng)一[12]，關(guān)于其對MCL是否有治療效果，實(shí)驗(yàn)較少。

此實(shí)驗(yàn)以MCL的Mino細(xì)胞系為研究對象，探究Hippo通路核心元件LATS1/2、YAP、TAZ的mRNA和蛋白的表達(dá)及其意義。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人MCL細(xì)胞Mino細(xì)胞株(由南京鼓樓醫(yī)院提供)及正常人(實(shí)驗(yàn)室健康人員3人)的外周血淋巴細(xì)胞均由我科長期液氮凍存。實(shí)驗(yàn)前按照細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)快速復(fù)蘇，在含10%胎牛血清(FBS)、2 mmoL/L谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。DAC及BTZ由揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院血液科惠贈(zèng)，F(xiàn)BS、RPMI1640培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國HyClone公司，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，BAC蛋白濃度測定檢測盒(SDS-PAGE凝膠2配置試劑盒)購自上海碧云天，LightCycler? 96 System熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司，引物由華大基因公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR

嚴(yán)格按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄已定量的RNA，以GAPDH為內(nèi)參照，配置反應(yīng)體系為 10μl，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 30sec 1 個(gè)循環(huán)，95℃ 10s、60℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。在熒光定量PCR儀上行RT-PCR，采用2-△△Ct法計(jì)算每個(gè)復(fù)孔的相對表達(dá)量，然后再計(jì)算每個(gè)樣本的相對表達(dá)量的均值。

1.2.2 Western blot

采用細(xì)胞裂解液提取蛋白，并按SDS-PAGE凝膠2配置試劑盒采用BCA法測定蛋白濃度。配制濃縮膠(濃度5%)及分離膠(檢測LATS1/2時(shí)采用8%；檢測YAP/TAZ時(shí)采用 10%)，將總蛋白 (LATS1采用 80μg；LATS2、YAP/TAZ 采用100μg)在上樣緩沖液中煮沸5min，于相應(yīng)濃度的SDSPAGE進(jìn)行電泳，然后電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜用含5%的脫脂奶粉于室溫封閉2h，分別加一抗于含5%脫脂奶粉的TBST中，4℃過夜，次日用PBS清洗10min×3次，加入二抗室溫下緩慢震蕩孵育1.5h，再次清洗10min×3次，曝光。

1.3 觀察細(xì)胞生長情況

取對數(shù)生長期細(xì)胞，新鮮培養(yǎng)液洗滌后，重懸于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中。分別加入濃度為1uM、2uM、4uM的 DAC和 100nM、200nM、300nM 的 BTZ。空白對照組以培養(yǎng)液補(bǔ)足。處理12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)后，分別加入MTT工作液(終濃度為0.5 mg/mL)，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4小時(shí)后，再離心吸上清，加入DMSO，使藍(lán)紫色甲脫沉淀溶解，在酶標(biāo)儀570 nm波長處讀取吸光度(A)值。按以下公式計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

細(xì)胞存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白對照組)/(A陰性對照組-A空白對照組)*100%

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，所用數(shù)據(jù)用Graph Pad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mino細(xì)胞系中LATS1、LATS2、YAP、TAZ的mRNA的表達(dá)

采用RT-PCR方法檢測套細(xì)胞淋巴瘤Mino細(xì)胞系及3例正常人外周血淋巴標(biāo)本中LATS1、LATS2、YAP及TAZ的mRNA的表達(dá)水平。與正常人(DC、ZLN、ZXW)外周血淋巴細(xì)胞相比，LATS 1、LATS2、YAP及TAZ的mRNA在Mino細(xì)胞系中的表達(dá)下調(diào)并明顯低于正常人(P＜0.0001)。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測Mino細(xì)胞系和正常對照(DC、ZLN、ZXW)中的LATS1、LATS2、YAP、TAZ的mRNA表達(dá)水平(＊＊為P＜0.0001)

2.2 Mino細(xì)胞系中LATS1、LATS2、YAP、TAZ的蛋白的表達(dá)

Western blot分析顯示，在套細(xì)胞淋巴瘤Mino細(xì)胞系中LATS1、LATS2、YAP、TAZ的蛋白表達(dá)均明顯低于正常人，見圖2、3。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在套細(xì)胞淋巴瘤Mino細(xì)胞系及正常人中，LATS1的表達(dá)均高于LATS2。另外，需要注意的是，Mino細(xì)胞系中出現(xiàn)“一分子量在95-140kDa之間的條帶”的原因尚未明確。

圖2 Western blot檢測Mino細(xì)胞系和正常對照(DC、ZLN、ZXW)中的LATS1的蛋白表達(dá)水平

圖3 Western blot檢測Mino細(xì)胞系和正常對照(DC、ZLN、ZXW)中的LATS2、YAP、TAZ的蛋白表達(dá)情況

所有這些結(jié)果表明，HIPPO信號通路在套細(xì)胞淋巴瘤Mino細(xì)胞系中處于抑制狀態(tài)或者受其他通路交叉調(diào)控。

2.3 加 入 DAC 后，Mino細(xì)胞中LATS1、LATS2、YAP、TAZ的mRNA及蛋白的表達(dá)

文獻(xiàn)及selleck官網(wǎng)提示[13]，地西他濱1uM培養(yǎng)48小時(shí)即可有增殖抑制作用，文獻(xiàn)中使用4uM，再選取2uM兩個(gè)梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，見圖4，LATS1、LATS2、TAZ的mRNA的表達(dá)較前升高，但仍明顯低于正常人(P＜0.0001)。加入2uM地西他濱后Mino細(xì)胞出現(xiàn)YAP的mRNA的表達(dá)下降，地西他濱4uM組表現(xiàn)為YAP的mRNA的表達(dá)增高。LATS1、LATS2、YAP、TAZ的蛋白表達(dá)未檢測出明顯變化，見圖5。

圖5 Western blot檢測加入DAC和BTZ后，Mino細(xì)胞系和正常對照(DC、ZLN、ZXW)中的LATS1、LATS2、YAP、TAZ蛋白表達(dá)情況

2.4 加 入BTZ后，Mino細(xì) 胞 中 LATS1、LATS2、YAP、TAZ的mRNA及蛋白的表達(dá)

已有文獻(xiàn)報(bào)道Mino細(xì)胞系為BTZ耐藥株，使用濃度差異較大，需使用50nM以上濃度，鑒于Raji細(xì)胞系使用1uM，故BTZ 濃度選取 300nM[14,15]，見圖4，LATS1、LATS2、YAP、TAZ的mRNA的表達(dá)較前升高，但仍明顯低于正常人(P＜0.0001)。LATS1蛋白仍表現(xiàn)為95-140kDa的條帶，表達(dá)明顯下降，LATS2、YAP、TAZ的蛋白表達(dá)未檢測出明顯變化，見圖5。

圖4 RT-PCR檢測加入DAC和BTZ后，Mino細(xì)胞系和正常對照(DC、ZLN、ZXW)中的LATS1、LATS2、YAP、TAZ的mRNA表達(dá)水平(＊＊為 P＜0.0001)

2.5 加入DAC及BTZ后的套細(xì)胞淋巴瘤Mino細(xì)胞生長情況

結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)，再將DAC分為1uM、2uM和4uM三個(gè)濃度梯度后觀察Mino細(xì)胞生長，24小時(shí)后三組Mino細(xì)胞均出現(xiàn)少量異性，數(shù)量稍減少；加入48小時(shí)后細(xì)胞數(shù)量下降明顯，4uM中的細(xì)胞減少更為明顯，見圖6。

圖6 加入不同濃度DAC后，Mino細(xì)胞的生長情況

將BTZ分為100nM、200nM、300nM三個(gè)梯度觀察細(xì)胞形態(tài)，其中BTZ 300nM組加入后24小時(shí)即出現(xiàn)明顯體積增大，有空泡，考慮凋亡前期，故立即提取蛋白及RNA，未再培養(yǎng)做48小時(shí)后的觀察，見圖7。

圖7 加入不同濃度BTZ后，Mino細(xì)胞的生長情況

3 討論

Hippo信號通路是一條在進(jìn)化上高度保守的抑癌信號通路，最初在果蠅內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Hippo信號通路被激活，Wts、Sav、Hpo、Mats四種腫瘤抑制因子完成激酶級聯(lián)反應(yīng)后，下游的轉(zhuǎn)錄共激活因子Yki被磷酸化失活，滯留在胞質(zhì)內(nèi)被降解，Yki表達(dá)減少，完成傳遞細(xì)胞凋亡任務(wù)。如果Yki未磷酸化(或Hippo通路失活)，則Yki表達(dá)后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，若與最常見的TEAD家族成員結(jié)合，則可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，抑制凋亡[2-6]。Yki過度表達(dá)可反過來抑制由Hippo通路失活引起的組織過度生長，以此調(diào)控組織大小達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。以上關(guān)鍵因子均為Hippo通路核心元件，對應(yīng)到哺乳動(dòng)物，就包括了此次實(shí)驗(yàn)我們重點(diǎn)關(guān)注的核心元件，LATS1/2(Wts同源蛋白)、YAP/TAZ(Yki同源蛋白 )[2-6]。

已有大量研究證實(shí)，Hippo信號通路核心元件的基因突變、缺失或各種原因?qū)е碌耐肥Щ钆c人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移，甚至耐藥都有密切關(guān)系[2,6]。LATS已知與誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯相關(guān)，在Hippo通路中則通過降低YAP的表達(dá)而發(fā)揮它抑癌基因的作用，而LATS在乳腺癌、直腸癌、宮頸癌、皮膚癌等實(shí)體腫瘤中低表達(dá)[16]。LATS的低表達(dá)可能與基因突變、甲基化改變或其他因子調(diào)控相關(guān)[16]。在已有的Hippo通路在血液系統(tǒng)惡性腫瘤作用的研究中，LATS的作用并不明確。在慢性粒細(xì)胞白血病(CML)中，LATS2可能獨(dú)立于Hippo信號通路以高表達(dá)為主[17]。在成人NK/T細(xì)胞白血病中，LATS2低表達(dá)與白血病細(xì)胞凋亡減少和耐藥相關(guān)；在急性淋巴細(xì)胞白血病中，LATS2因甲基化所致的低表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[4,5,18]。于珍等的實(shí)驗(yàn)提出LATS1、LATS2的mRNA在MCL患者中表達(dá)低，且與不良預(yù)后相關(guān)，與本次實(shí)驗(yàn)中的結(jié)論相同，提示了LATS1/2可能在MCL中表現(xiàn)為抑癌因子[19]。另外，本次實(shí)驗(yàn)中多次Western blot實(shí)驗(yàn)中均提示Mino細(xì)胞系中LATS1與正常人淋巴細(xì)胞中分子量不同，需考慮“是否為雜帶、發(fā)生突變、剪切體不同”等可能，必要時(shí)測序或蛋白修飾檢測。

YAP(TAZ與YAP同源)則被發(fā)現(xiàn)具有促癌和抑癌的雙重功能，YAP過表達(dá)大多與實(shí)體腫瘤細(xì)胞的增殖、逃避凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥等呈正相關(guān)，如在結(jié)腸癌、肺癌、甲狀腺癌、卵巢癌中呈現(xiàn)促癌作用[3,5,6]。另一研究發(fā)現(xiàn)，YAP在多發(fā)性骨髓瘤中作為強(qiáng)大的腫瘤抑制因子呈低表達(dá)，可能與DNA損傷導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)ABL1重新定位，相關(guān)的ABL1-YAP1-p73軸失調(diào)，而導(dǎo)致的細(xì)胞增殖有關(guān)[20,21]。在CML、急性T細(xì)胞白血病、急性早幼粒白細(xì)胞中，YAP均呈高表達(dá)，提示了YAP的致癌作用[4,5,17,18]。Hippo通路在淋巴瘤中作用的研究較少，現(xiàn)有研究提出YAP可能參與成熟B細(xì)胞分化,在良性淋巴組織、惰性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤及MCL中廣泛表達(dá)[22,23]。在NK/T細(xì)胞淋巴瘤的組織和細(xì)胞系中也有顯著的YAP表達(dá)上調(diào)，抑制YAP表達(dá)后，Hippo通路下游靶基因(與細(xì)胞增殖相關(guān)的)表達(dá)降低，抑制腫瘤細(xì)胞增殖同時(shí)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡， Hippo信號通路的激活可抑制NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展[24]。在侵襲性較高的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)中YAP表達(dá)較良性淋巴組織低[22,23]。在另一文獻(xiàn)中提出YAP mRNA在DLBCL中高表達(dá)且不良預(yù)后呈正相關(guān)[25]。此次實(shí)驗(yàn)提示套細(xì)胞淋巴瘤Mino細(xì)胞系中YAP/TAZ mRNA及蛋白表達(dá)均明顯低于正常對照組，分析原因如下：1)可能與文獻(xiàn)中采用的細(xì)胞類型與本實(shí)驗(yàn)不同及疾病不同階段相關(guān)；2)可能與不同的細(xì)胞代謝條件，過度傳代，突變或其他克隆進(jìn)化有關(guān)。

蛋白酶體抑制劑硼替佐米在十多年前已經(jīng)被批準(zhǔn)用于復(fù)發(fā)/難治性MCL，主要通過對26S蛋白酶體的抑制發(fā)揮作用，從影響細(xì)胞周期、細(xì)胞微環(huán)境等方面制約MCL細(xì)胞的生長[11]。研究提出在MCL中存在顯著和異常的啟動(dòng)子甲基化，DNA甲基化特異性抑制劑地西他濱處理MCL細(xì)胞株可逆轉(zhuǎn)異常甲基化，在MCL其他細(xì)胞株中也被證實(shí)[26-30]。近期有也研究表明DAC與BTZ呈正協(xié)同作用，是治療MCL的有益嘗試[31]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DAC和BTZ均可誘導(dǎo)套細(xì)胞淋巴瘤Mino細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡，并提升LATS1/2、YAP/TAZ mRNA的表達(dá)，BTZ組表現(xiàn)更為明顯。在蛋白表達(dá)層面，出現(xiàn)BTZ組LATS1蛋白表達(dá)明顯下降，其余元件蛋白水平無明顯變化，可能與NF-kB通路與Hippo通路有交叉調(diào)控或藥物濃度相關(guān)。可進(jìn)一步補(bǔ)充細(xì)胞IC50、凋亡、增殖或者使用其他MCL細(xì)胞系等實(shí)驗(yàn)，綜合分析藥物作用。另外，BTZ 300nM組24小時(shí)便出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，伴有LATS1蛋白表達(dá)下降，可考慮將濃度可進(jìn)一步降低，進(jìn)行觀察。另外，蛋白表達(dá)未見明顯改變的DAC組，可考慮延長共培養(yǎng)時(shí)間至72小時(shí)。

綜上所述，我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCL中的LATS1/2、YAP/TAZ以低水平表達(dá)為主，提示MCL中的Hippo信號通路主要呈抑制狀態(tài)，YAP/TAZ的低表達(dá)考慮可能與其他通路的交互作用相關(guān)。DAC及BTZ有抑制MCL細(xì)胞生長的作用，且BTZ更明顯。提示通過藥物干預(yù)提高LATS1/2、YAP/TAZ mRNA的表達(dá)可能是治療MCL的有效途徑，Hippo信號通路可能是MCL治療的新靶點(diǎn)。