IL-37通過調控miR-23b-3p抑制非小細胞肺癌進展

黃宇波，王婕，哈依努爾

(1.新疆農業職業技術學院，新疆 昌吉 831100；2.新疆醫科大學第一附屬醫院呼吸科，新疆 烏魯木齊 830000)

0 引言

近幾年來肺癌已經成為全球發生率較高的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌(NSCLC)占85%[1]。在北美肺癌的死亡率已居各大腫瘤之首，甚至超過乳腺癌、結腸癌和前列腺癌死亡率的總和。盡管NSCLC的治療有很大的進展，但因病灶轉移率高和藥物耐藥性強，NSCLC的預后依然不理想[2]。腫瘤基因治療是目前研究的熱點之一，是一種潛在的治療策略。作為基因治療的分支，免疫療法引起了越來越多研究者的興趣，而尋求新的靶點和生物標志物是免疫療法的關鍵[3]。白介素37(IL-37)是一種細胞因子，屬于IL-1家族，2000年首次被發現[4]，被鑒定為先天免疫的天然抑制劑[5]。IL-37(IL-37a-e)有五個剪接變異體，IL-37b最大[6]。近年來有很多關于IL-37在免疫系統疾病中的研究，發現IL-37參與了肝細胞癌，腎癌，宮頸癌，非小細胞癌等癌癥的發生[7-10]。在纖維肉瘤中，注射IL-37可以抑制小鼠的腫瘤生長[11]。但是，有關IL-37在NSCLC中的研究較少。本研究首先通過免疫組化染色法檢測了20對肺鱗狀細胞癌和匹配的正常組織中IL-37的表達，然后，研究了IL-37在體外肺癌細胞株增殖和遷移中的作用。為IL-37在肺癌免疫治療中的作用提供了一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞系

NSCLC細胞株A549和正常人支氣管上皮細胞16HBE均購自武漢細胞庫。細胞在RPMI-1640培養基(Thermo Fisher scientific, MA, USA)中培養，添加10%胎牛血清(Thermo Fisher scientific, MA, USA)，37 ℃，5% CO2濕化空氣中培養。

1.2 CCK-8實驗

采用CCK-8法檢測細胞增殖。轉染后將6×103個肺癌細胞株A549接種到96孔板中。分別于24 h、48 h、72 h用CCK-8試劑(Beyotime, Shanghai, China)在暗箱中孵育2 h，最后用Benchmark Plus?微板光譜儀(Bio-RadLaboratories Inc)測定各孔在450 nm處的吸光度。

1.3 qRT-PCR實驗

使用TRIzol試劑盒(Thermo Fisher scientific, MA, USA)從細胞中提取RNA。采用EX Taq?II試劑盒(TaKaRa,Shiga,Japan)和 ABI Prism?7500(Applied Biosystems, CA, USA)進行IL-37水平檢測。使用PureLink?MiRNA分離試劑盒 (Thermo Fisher scientific, MA, USA)收 集 MiRNA，使 用TaqMan microRNA檢測試劑盒檢測MiRNA水平。內部對照為GAPDH和U6，引物序列如表1。

表1 引物序列

1.4 Transwell實驗

在無血清培養基中，接種2×104個A549細胞到無涂層或涂有基質凝膠的小室上層，底層加入750ul培養液。培養24 h后取出上層細胞，用4%多聚甲醛固定下層細胞，0.1%結晶紫染色。用光學顯微鏡對遷移和侵襲細胞數進行計數。

1.5 統計學方法

各試驗數據以均數±標準差表示，統計學意義采用兩組t檢驗分析。

2 結果

2.1 IL-37在NSCLC細胞系中表達上調

用qRT-PCR分析了IL-37在非小細胞肺癌細胞系中的表達。我們發現非小細胞肺癌細胞系A549的IL-37水平明顯低于正常人支氣管上皮細胞系16HBE(圖1)。

圖1 IL -37在非小細胞肺癌中的表達

2.2 IL-37的上調抑制非小細胞肺癌細胞增殖和遷移

為進一步驗證IL-37在非小細胞肺癌中的作用，我們將pLCDH-ciR-IL-37質粒轉染至A549細胞中過表達IL-37(P＜0.01 vs.pLCDH-ciR，圖2A)。CCK8實驗顯示，IL-37過表達抑制了A549細胞的生長(圖2B)。此外，Transwell實驗表明，IL-37的轉染抑制了A549細胞的遷移(P＜0.01 vs.pLCDH-ciR，圖2C)。這些數據顯示IL-37在非小細胞肺癌中具有抑癌作用。

圖2 IL-37上調抑制非小細胞肺癌細胞增殖和遷移

2.3 IL-37的下調促進非小細胞肺癌細胞增殖和遷移

為了探討IL-37在非小細胞肺癌中的潛在作用，轉染siRNA后，qRT-PCR分析顯示，IL-37在A549細胞中表達下調(P＜0.01 vs.siRNA-NC，圖3A)。然后進行CCK8實驗，發現沉默IL-37顯著增強了A549細胞的增殖能力(圖3B)。此外，采用Transwell實驗檢測IL-37基因敲除后的細胞遷移能力。結果表明，發現沉默IL-37顯著增強了細胞的遷移能力(圖3C)。這些數據進一步證明了IL-37抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和遷移。

圖3 IL-37沉默促進非小細胞肺癌細胞的增殖和遷移

2.4 IL-37可能通過調控 miR-23b-3p來發揮抑癌作用

我們使用軟件Starbase v2.0預測與IL-37相互作用的miRNA，發現miR-23b-3p可以與IL-37中的互補序列結合(圖4A)。我們用qRT-PCR分析miR-23b-3p在非小細胞肺癌細胞系中的表達，發現非小細胞肺癌細胞系A549的miR-23b-3p水平明顯低于正常人支氣管上皮細胞系16HBE(圖4B)。然后我們發現過表達miR-23b-3p在A549細胞中也增加了IL-37的表達(圖4C)；沉默IL-37導致A549細胞中miR-23b-3p水平降低(圖4D)，說明IL-37與miR-23b-3p關系密切。

圖4 IL-37可能通過調控miR-23b-3p發揮抑癌作用

3 討論

白介素37(IL-37)基因位于2號染色體的IL-1家族基因簇上，其蛋白與IL-1家族成員尤其是IL-8擁有共同的結構模型[12]。IL-37是一種天然的免疫應答抑制劑，能夠抑制多種炎癥因子的表達[13]。近些年研究表明,IL-37在腫瘤進展中也發揮著作用。Gao等人發現給MCA205纖維肉瘤鼠瘤內注射IL-37導致顯著抑制瘤體增長[14]；Zhao等人報道，在肝細胞癌中IL-37通過招募NK細胞到腫瘤微環境介導抗腫瘤免疫反應[15]；Wang等最近的研究發現IL-37通過抑制STAT3信號通路抑制宮頸癌細胞增殖和侵襲[16]；Jiang等人研究發現，IL-37通過IL-6/STAT3信號通路在腎癌中發揮抑癌作用[17]。盡管如此，IL-37在腫瘤發生、發展中的具體作用機制仍然未知。低濃度的TGF-β1能有效的誘導內源性的IL-37，IL-37能夠與Smad3形成復合物，體內外研究表明通過siRNA干擾內源性的Smad3，顯著降低了IL-37b的抗炎作用[18]。目前腫瘤免疫治療越來越被重視，研究IL-37有助于增進人們對腫瘤的新認識，為腫瘤的免疫治療提供新靶點。

本研究發現IL-37在非小細胞肺癌細胞系中低表達，提示IL-37可能是一種抑癌基因。此外，我們通過CCK8、Transwell等一系列實驗證實了IL-37對A549細胞的惡性行為具有抑癌作用。然而，IL-37抑制NSCLC的具體機制尚需深入研究。

本研究中的生物信息學預測方法提示：IL-37可能是miRNA-23b的靶向基因之一。因此，我們對能夠與IL-37互補結合的miRNA序列進行了分析，發現miR-23b-3p在3’-UTR上具有與IL-37互補的結合位點。有研究通過整合microRNA表達譜和基因組分析發現miR-23b-3p在胃癌組織中表達下調并具有生物學功能[19]。但miR-23b-3p在非小細胞肺癌中的生物學作用尚不清楚。本研究發現沉默IL-37在NSCLC中抑制miR-23b-3p的表達。

總之，本研究結果表明IL-37抑制NSCLC的發生，并且通過調控miR-23b-3p參與非小細胞肺癌的進展。通過本研究，我們對IL-37在非小細胞肺癌中的作用有了更好的了解，為IL-37在肺癌免疫治療中的作用提供了一定理論依據。