卵泡刺激素對上皮性卵巢癌細胞株SKOV-3、3AO增殖的影響

路曉琳，張潔雯，秦杰，郝娜，王巍巍，成艷梅

(邯鄲市中心醫院婦二科，河北 邯鄲 056001)

0 引言

上皮性卵巢癌屬于較為常見的惡性腫瘤，盡管隨著治療技術的進步，但本病患者預后差，療效仍然不理想。隨著我國對卵巢腫瘤發病機制的不斷進展[1]，不少學者發現本病高發期在患者絕經后的10～20年內，體內促性腺激素水平呈上升趨勢[2]。也有研究發現FSH對卵巢腫瘤細胞株SKOV-3、3AO增殖具有一定的促進作用，基于此本研究旨在探究FSH對上皮性卵巢癌細胞株SKOV-3、3AO增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 SKOV-3、3AO細胞株

院內婦科實驗室、試驗中心本研究提供研究樣本，分別為SKOV-3、3AO細胞株，上述細胞樣本均使用培養基(RPMI-1640)加以培養。

1.1.2 藥品

選擇重組人卵泡刺激素(靜脈注射，美國)。

1.2 方法

SKOV-3、3AO從液氮中取出后，將其放入溫水中，溫水溫度為37℃，搖晃至完全融化，基于無菌操作下，離心，將凍存液去掉(1000轉/min)，PBS液洗滌一次，離心去PBS，加入含胎牛素 (10%)、青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL的RPMI-1640培養基1mL懸浮細胞，將細胞置入培養瓶。補充培養液，直至5mL，細胞培養放置于培養箱中(溫度37℃)，5%的二氧化碳。或進行進一步的傳代培養，吸出培養液，在SKOV-3、3AO細胞長滿至80%融合后，選取PBS液沖洗，沖洗次數2次，在培養瓶內加入胰蛋白酶-EDTA消化液(濃度0.25%，劑量2mL)，輕輕搖晃，在倒置顯微鏡下觀察，待細胞變成圓形，細胞連接減少后將消化液去掉，加入培養基(2mL)，以停止消化。并輕輕反復吸吹液體沖打瓶壁，使細胞脫落，加入培養液懸浮細胞并分別轉入2個培養瓶中，補給培養液，繼續培養。SKOV-3、3AO細胞接種于放有蓋玻片的培養皿中培養，待細胞貼壁生長至對數生長期，換用分別含有不同濃度FSH和LY294002的新鮮培養基，定時鏡下觀察并照相。液體需反復吸氣，注意動作輕柔，以沖打瓶壁，細胞產生脫落，培養液懸浮細胞加入后，分別準備2個培養瓶，轉入，補給培養液，繼續培養。將SKOV-3與3AO細胞進行接種，并放置于培養皿中，當細胞貼壁生長到對數生長期，可將其放置新鮮培養基中的培養，一個培養基含有不同濃度的FSH，一個培養基含有LY294002，取對數生長期SKOV-3、3AO細胞經胰酶消化后，調整細胞濃度為1×105/mL，每孔100μl接種于96孔板，培養6-8h，待細胞貼壁后，換為含藥的培養液。分別設對照組(不含藥培養基)，空白對照組(只加培養基，不加細胞 )，不同濃度 FSH(10、20、40、80、160mIU/mL)和 10μmol/L LY294002單獨及LY294002作用半小時后聯合FSH各為一組，每組設5個復孔，重復三次。分別培養12、24、48、72h后。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 FSH對SKOV-3、3AO的影響

在倒置相差的顯微鏡下觀察FSH40mIU/mL處理相同細胞數的SKOV-3細胞48h、3AO細胞24h后細胞胞體形均變長或呈多角形，形態飽滿，部分區域疊加生長，胞核較前稍微增大，細胞時長狀態良好，其密集度顯著高于對照組。見表圖1、圖2。

圖1

圖2

2.2 不同濃度下FSH在SKOV3不同時點的增殖情況

FSH濃度達到40mIU/mL時，且SKOV細胞作用于48h的細胞增殖率最高，不同濃度組間相較存在統計學意義(P＜0.05)；而不同時點組間相較不存在統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 不同濃度下FSH在SKOV3不同時點的增殖情況(n=3)

2.3 同濃度下FSH在3AO不同時點的增殖情況

FSH濃度達到40mIU/mL時，且3AO細胞作用于24h的細胞增殖率最高，不同濃度組間相較存在統計學意義(P＜0.05)；而不同時點組間相較存在統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 不同濃度下FSH在SKOV3不同時點的增殖情況(n=3)

3 討論

有研究發現，在卵巢表面上皮、卵巢表面上皮包涵囊腫、卵巢上皮腫瘤存在FSHR表達。還有研究指出，促性激素不僅存在卵巢表面上皮(正常)，也存在于卵巢細胞中，而且該研究還顯示，FSHRF不僅在卵巢表面上皮細胞(正常)有大量表達，而且在卵巢癌OCC1細胞中也有較高的表達，這個研究提示FSHR的存在能為FSH作用提供一定的靶點。另外也有研究指出FHS對卵巢癌AO細胞具有一定的增殖作用[3]，FHS可與片段結合，體現FSH對卵巢癌細胞具有較強的增殖作用，而FSH可借助FSHR促進SKOV-3、3AO細胞的增殖[4]。本研究顯示，經倒置顯微鏡顯示，SKOV-3、3AO細胞經FSH作用后，濃度隨著時間的延長而增加，另外細胞形態、細胞生長速度、細胞密度均有所改變。FSH濃度達到40mIU/mL時，且SKOV細胞作用于48h的細胞增殖率最高，不同濃度組間相較存在統計學意義(P＜0.05)；而不同時點組間相較不存在統計學意義(P＞0.05)。FSH作用關系即為時間和劑量呈現依賴關系。這結果說明SKOV-3中當FSHR存在弱表達時，這可能會減弱FSH的刺激作用，FSH對細胞增殖促進作用和細胞FSHR的陽性表達存在緊密的聯系。

綜上所述，FHS對卵巢癌SKOV-3、3AO起到的增殖作用是較強的，作用濃度最強可能是由增殖峰最高濃度來反映。