紅細胞膜包裹的雷公藤紅素仿生納米粒的制備與表征

郭玲，張永萍，徐劍，劉耀，汪祖華，宋信莉

(貴州中醫藥大學藥學院，國家苗藥工程技術研究中心，貴州省中藥民族藥炮制與制劑工程技術研究中心，貴州 貴陽550025)

0 引言

雷公藤紅素(celastrol，CLT)，又名南蛇藤素，是從我國傳統中藥雷公藤根部提取得到的五環三萜類化合物[1]。現代研究表明，CLT具有抗炎、免疫抑制、抗癌、抗病毒以及神經保護等藥理活性[2]，對多種腫瘤或炎癥性疾病均產生了潛在的治療作用。然而CLT水溶性差，生物利用度低，給藥后在體內廣泛分布極易產生全身性毒不良反應[3]，嚴重限制了其臨床應用。近年來，越來越多的研究通過將難溶性藥物制成納米制劑[4]，以克服其溶解度低、生物利用度差的問題，并可增強藥物靶向性，達到增效減毒的作用。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid, PLGA)是納米遞藥系統的常用載體[5]，安全無毒且具有良好的生物可降解性和生物相容性。盡管PLGA納米粒在一定程度上改善了負載藥物的理化性質，但其靜脈給藥后，易受血漿中調理素的攻擊和血漿蛋白的吸附，進而被網狀內皮系統識別而快速清除。

近年來，研究者們嘗試以新型仿生材料修飾納米粒進行偽裝，使其避開網狀內皮系統的識別。其中紅細胞膜仿生修飾納米粒引起了廣泛關注，紅細胞是機體血液中數量最多且壽命最長的細胞，其血液循環時間可長達120天[6,7]。將天然紅細胞膜直接包裹納米粒得到的仿生修飾載藥系統不僅具有長循環作用，而且其半透膜性質還能控制藥物緩慢釋放，在生物醫藥領域表現出極大的發展潛力和應用空間[8]。基于此，本實驗首先通過納米沉淀法制備負載CLT的PLGA納米粒 (celastrol-loaded PLGA nanoparticle, CLT-NP)，改善藥物溶解度差的問題。同時，利用紅細胞膜的長循環及天然免疫逃逸的優勢，通過擠出法將紅細胞膜包裹在CLT-NP表面，構建仿生納米制劑(red blood cell membrane coated CLT-NP,RBC-CLT-NP)，提高其生物利用度、延長血液循環時間，為CLT新制劑的研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

5810R型高速離心機(德國Eppendorf公司)；脂質體擠壓器(美國Avanti公司)；Nano ZS90型激光粒度分析儀(英國Malvern公司)；H-600型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；Varioskan Flash型多功能酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司 )。

1.2 主要試劑

雷公藤紅素(CLT；純度＞ 98.0 %；成都普菲德生物科技有限公司 )；PLGA(50:50，Mw 52000～60000，成都電子科技大學 )；普郎尼克F127(美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，北京索萊寶科技有限公司)；吐溫80(Tween 80，北京百靈威科技有限公司)。

1.3 實驗動物

健康雄性SD大鼠(SPF級，體重180～200 g，長沙市天勤生物技術有限公司)。

2 方法

2.1 CLT-NP的制備

采用納米沉淀法制備CLT-NP[9]：將3 mg CLT和10 mg PLGA溶于1 mL DMSO中，超聲溶解后于攪拌下逐滴加至3 mL 0.1% F127水溶液中，攪拌1 h后，轉至透析袋除去DMSO和游離CLT，即得橙黃色半透明的均一納米粒膠體溶液CLT-NP。

2.2 紅細胞膜的提取和純化

采用低滲法提取紅細胞膜[10]：取SPF級SD大鼠，以心臟穿刺方法取全血于含肝素鈉的離心管中，在4°C，3000 rpm離心5 min，棄去上層血漿及淡黃色的絨毛狀沉淀。將得到的壓積紅細胞用預冷的1×PBS洗滌2-3次至上清液無色。按壓積紅細胞與低滲緩沖液1:40 的比例加入預冷的0.25×PBS，混勻于4°C 溶血 3 h后，在 4 °C，9000 rpm離心15 min，棄去上清液，同法重懸洗滌3次，收集底部淺粉紅色團塊，即為紅細胞膜。

2.3 RBC-CLT-NP的制備

采用擠出法制備RBC-CLT-NP[9]：先將紅細胞膜進行超聲破碎處理(100 W，1 min)，再采用擠出器依次使用孔徑為800 nm、400 nm、200 nm的聚碳酸酯薄膜來回擠壓10次，得到紅細胞膜納米小體。將適量納米小體與CLT-NP進行混合，再過200 nm的膜擠壓10次，即得到RBC-CLT-NP溶液。

2.4 CLT-NP和RBC-CLT-NP的表征

2.4.1 粒徑和Zeta電位的測定

取CLT-NP和 RBC-CLT-NP加水適量稀釋后，通過激光粒度儀分別測定其粒徑及Zeta電位。

2.4.2 形態學觀察

取一定量的CLT-NP和 RBC-CLT-NP加水適當稀釋后，分別滴至覆有碳膜的銅網上，采用2 %磷鎢酸進行負染，在透射電鏡下觀察各自形態。

2.4.3 穩定性考察

將CLT-NP和RBC-CLT-NP儲存至室溫條件，隔天分別測定各自的粒徑，考察穩定性。

2.5 CLT-NP和RBC-CLT-NP的體外釋放考察

2.5.1 標準曲線繪制

精密稱取50 mg CLT對照品，加入DMSO溶解配成10 mg.mL-1的貯備液。精密量取一定體積的該貯備液用1% Tween 80溶液作梯度稀釋，制備一系列不同濃度的CLT標準溶液。用多功能酶標儀測定其在425 nm波長處的吸光度值A。將吸光度值(A)對CLT濃度(C)進行線性回歸，并繪制標準曲線。

2.5.2 體外釋放實驗

取2 mL RBC-CLT-NP溶液和1.18 mg CLT溶液分別加入至已經活化并洗凈的透析袋中(平均截留分子量為3500 Da)，以1% Tween 的PBS溶液作為釋放介質，將兩端扎緊的透析袋完全浸入裝有40 mL釋放介質的EP管中，置于恒溫(37℃ )搖床中 100 rpm振蕩。分別于0.5，1，2，4，6，8，24 h，吸出1 mL釋放介質，同時補加相同體積的新鮮釋放介質。測定取出介質在425 nm處的吸光度值(A)，將測得的A值代入標準曲線，計算釋放量和累積釋放率。

3 結果

3.1 CLT-NP和RBC-CLT-NP的表征

3.1.1 粒徑和Zeta電位的測定

經激光粒度儀測得CLT-NP的粒徑為(105.4±1.9)nm，Zeta電位為(-14.6±2.7)mV；包裹紅細胞膜后RBC-CLT-NP的粒徑為(120.6±3.9)nm，Zeta電位為(-27.6±2.1)mV；包裹紅細胞膜前后粒徑相差15.2nm，與文獻報道細胞膜尺寸相符[11]，表示細胞膜成功包裹在CLT-NP表面。

3.1.2 形態觀察

如圖1所示，CLT-NP呈類球形，RBC-CLT-NP可見到明顯的特征性核-殼結構。

圖1CLT-NP(左)和RBC-CLT-NP(右)的透射電鏡圖

3.1.3 穩定性考察

由圖2可知，CLT-NP和RBC-CLT-NP儲存在室溫條件下7天內粒徑依然保持穩定。

圖2 CLT-NP和RBC-CLT-NP室溫條件下的粒徑變化(n=3)

3.2 體外釋放實驗

根據CLT標曲曲線A=0.0145C+0.0244(R2=0.9999)，分別計算CLT原料藥和RBC-CLT-NP的累積釋放率，結果如圖3所示。可見游離CLT在24 h內幾乎全部釋放，而藥物從RBC-CLT-NP中釋放較緩慢，24 h累積釋放率約為30%，呈現了較好的緩釋特性。

圖3 CLT和RBC-CLT-NP的體外釋放曲線(n=3)

4 討論

本研究嘗試在CLT-NP表面包裹紅細胞膜進行仿生修飾，以延長傳統納米制劑的體內循環時間。采用低滲溶血法促使紅細胞膜破裂以釋放其內容物，并通過離心法收集紅細胞膜，然后采用超聲破碎和機械擠出法制備紅細胞膜納米小體，經與CLT-NP混合后擠出制備得到RBC-CLT-NP。

激光粒徑儀測定結果顯示，與CLT-NP相比，RBC-CLTNP的粒徑增加了約15 nm，正好是紅細胞膜理論厚度的2倍左右[11]。透射電鏡的結果顯示，RBC-CLT-NP呈現清晰的“核-殼”結構。這些結果表明，在機械擠出器的作用下，紅細胞膜已被成功包裹在PLGA納米粒表面。制得的RBCCLT-NP具有很好的穩定性，在超純水中7天內粒徑未發生明顯變化。考察其體外釋放行為，發現RBC-CLT-NP相較于原藥CLT具有顯著的緩釋作用。后期，筆者將進一步探究RBC-CLT-NP的體內分布行為及治療疾病的效果，為以后更深入研究CLT臨床用藥提供新的思路和方法。