紅景天苷對糖尿病大鼠腎功能及MMP-9表達的影響

陳俞潔，楊洲，高靜媛，于曉龍，邢磊

(華北理工大學附屬醫院全科醫學科，河北 唐山 063000)

0 引言

糖尿病腎病(Diabetic Nephrapathy，DN) 是糖尿病患者終末期最危險的微血管并發癥之一，又稱糖尿病腎小球硬化癥，是世界范圍內慢性腎臟病的最常見的原因，其發病率呈現逐年上升趨勢[1]。目前，糖尿病腎病的確切病因尚不清楚，但各種推測的機制是：腎血流動力學異常、高血糖癥、高血壓、糖基化產物、細胞因子、遺傳因素的激活等相互作用所導致[2]。紅景天苷[3](4-羥基-苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，Salidroside)，是紅景天屬植物中廣泛存在的酚苷類化合物。紅景天苷可增加血清胰島素水平以及抗氧化酶活性，在一定程度上對糖尿病腎病起到了保護作用，但其具體機制不詳，為進一步研究紅景天苷在延緩糖尿病腎病中的作用機制，本次研究通過制備動物模型實驗，用于研究紅景天苷治療糖尿病腎病的療效觀察。

1 材料

1.1 實驗動物

選取清潔級健康SD大鼠，雄性，體重(250±50)g，共60只，購自中國解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究學所，許可證號：SCXK (軍) 2009-003。

1.2 實驗材料

全自動生化分析儀(日立7600系列)；紅景天苷(salidroside，北京索來寶生命科學公司)；鏈脲佐菌(streptozotocin，STZ，Sigma公司)；多克隆兔抗鼠MMP-9(abcam 公司)、山羊抗兔IgG聚合物免疫組化試劑盒、DAB顯色劑(中杉金橋)；高糖高脂飼料(普通鼠飼料加蔗糖、煉豬油和蛋黃按比例加工制成，其比例為豬油18%、蔗糖20%、蛋黃3%、基礎飼料59%)。尿毒清顆粒以1:1比例溶于蒸餾水，加熱至溶解，備用。用0.1mmol/L 無菌枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.2，4℃) 將STZ配成2%的溶液，備用。

1.3 動物分組及處理

動物適應性喂養1周后，隨機抽出10只為正常對照組(NC)，50只大鼠造模成功后，隨機分成5組。每組每日上午灌胃給藥1次，共8周。各組的設置及處理如下：

(1) 正常對照組(NC)：大白鼠10只，同劑量的腹腔注射生理鹽水。

(2) 糖尿病腎病組(DN組)：模型鼠10 只，同劑量的腹腔注射生理鹽水。

(3) 紅景天苷低劑量組(SL)：模型鼠10 只，1g/kg。

(4) 紅景天苷中劑量組(SM)：模型鼠10 只，2g/kg。

(5) 紅景天高劑量組(SH)：模型鼠10 只，4g/kg。

(6) 尿毒清顆粒組(UCG組)：模型鼠9只，40 mg/kg

1.4 造模方法

50只大白鼠給予高糖高脂飼料喂養，禁食12 h，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，60mg/kg)。注藥后72h后由尾靜脈取血測空腹血糖(FPG)，連續3次隨機血糖≥16.7mmol/L， 即糖尿病造模成功。繼續飼養3周，檢測24h尿微量白蛋白(mALB)>30mg/kg·d，即糖尿病腎病模型成功。本次實驗1只大鼠尿蛋白未達標，即成模率96.3%。

1.5 檢測方法

1.5.1 生化指標檢測和標本采集

各組大鼠禁食12h，稱量體質)BW)，經尾靜脈采血，測量空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)，并計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR；HOMAIR=FPG×FINS/22.5)，留取24h尿液測mALB。按照不同劑量紅景天苷和尿毒清顆粒治療8周后，禁食12h，稱量各組大鼠體質，以10%水合氯醛 3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，經腹主動脈取血，檢測FPG、FINS、BUN、Scr、mALB；分離并取出左腎，行生理鹽水沖洗后沿橫斷面切割組織，分成大小為0.5cm×0.5cm×0.5cm，留置10%中性甲醛中固定。取已固定的腎組織裝入包埋盒中，生理鹽水沖洗過夜后，按梯度乙醇脫水，石蠟包埋、5um連續切片。其余組織放入-80℃中保存待檢。

1.5.2 蘇木素-伊紅(HE)染色

石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染色5min，1%鹽酸乙醇分化5s，流水沖洗返藍，伊紅染色3min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性膠封片。HE染色切片制作完成后，于光學顯微鏡下觀察腎小管上皮細胞變性、萎縮、腎間質纖維化等病變。

1.5.3 免疫組織化學顯色

常規按免疫組化SP法進行。將載有石蠟切片的載玻片置于60℃恒溫箱中烘烤15min，常規脫蠟5min、脫水3mim；PBS漂洗3次；高壓抗原修復；3%內源性過氧化氫酶阻斷劑50μL，孵育15min；加一抗(1:50)，PBS代替一抗進行染色作為對照，在4℃孵育過夜；PBS漂洗3次，每次3min；加入二抗IgG，37℃孵育60min；PBS漂洗3次，每次3min；DAB避光顯色3min；空氣干燥后中性樹膠封片；每張切片隨機選擇20個不重疊視野，計數每個腎小球內MMP-9染色陽性(棕黃色)足細胞數量。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 給藥前后各組大鼠血糖及胰島素比較

給藥前，模型組和紅景天苷藥物組FPG、FINS、HOMAIR水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。給藥8周后，組間FPG、FINS、HOMA-IR差異均具有統計學意義(P<0.05)，兩兩比較顯示，各劑量的紅景天苷藥物組FPG、FINS、HOMAIR低于模型組，且SM組、SH組的FPG低于SL組及UGC組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血糖及胰島素比較

2.2 給藥前后各組大鼠腎功能及尿蛋白比較

給藥前，模型組和紅景天苷藥物組BUN、Scr及24h mALB水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；給藥8周后，組間BUN、 Scr及24h mALB水平差異均有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較顯示，模型組和紅景天苷藥物組BUN、 Scr及24h mALB均高于正常對照組，紅景天苷藥物組的BUN、 Scr及24h mALB低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，且SM組、SH組的FPG低于SL組及UGC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠BW及腎功能比較

2.3 各組大鼠腎組織病理學結果

對照組大鼠，腎小球、腎小管、腎間質結構正常，形態規整未見明顯病理學改變(見圖1-1)；模型組，系膜基質顯著增多，伴隨腎小球增生，基底膜變厚、增寬，腎小管擴張，腎小管區開始出現輕度纖維化，足細胞數量不多(見圖1-2)；低劑量組(見圖1-3)和中劑量組(見圖1-4)腎組織病理損傷較DM組減輕，腎小球體積略有增大，基底膜未見明顯增厚；高劑量組組(見圖1-5)，足細胞個數多；且腎組織病理損傷明顯減輕，但較對照組大鼠腎組織仍有損傷。

圖1 大鼠大鼠HE染色鏡下腎組織病理學改變

2.4 各組大鼠MMP-9的表達

顯微鏡下觀察可見，MMP-9經免疫組化染色后顯色為棕黃色，主要表達于腎小球及腎小管區域。模型對照組(見圖2-2)與正常對照組(見圖2-1)相比，大鼠腎組織MMP-9的表達明顯下調；與模型對照組組相比，低、中、高劑量紅景天苷組(見圖2-3、圖2-4、圖2-5)的腎組織MMP-9的表達明顯上調。經顯微鏡下觀察，對照組MMP-9陽性足細胞數量為0.75±0.26個；模型對照組MMP-9陽性足細胞數量為3.78±0.29；低、中、高劑量紅景天苷組MMP-9陽性足細胞數量分別為5.23±1.88、7.60±1.80、14.22±1.01個，呈逐漸增高趨勢，且均高于模型對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 各組大鼠免疫組織化學染色MMP-9的表達

3 討論

糖尿病腎病發病初期主要是腎小球損傷所致的蛋白尿，后期發展成慢性腎功能衰竭主要是因為腎小管和腎間質的病變，即主要病理基礎是腎間質纖維化。近年來，細胞外基質(extracellulaar matrix，ECM)的檢測作為糖尿病腎病的早期預測指標日益受到重視，即糖尿病腎組織表現為細胞外基質重塑從而引發糖尿病腎病間質纖維化[4]。

生理狀態下，在分泌合成細胞外基質的同時，系膜細胞可以降解分布在其中的金屬蛋白酶，以避免細胞外基質過度聚集[5]；病理狀態下細胞外基質的相互作用、過度沉積、分解減少和損傷是導致其代謝紊亂失衡的原因，且不斷取代腎小球組織，造成腎小球硬化，這種由多因素控制的細胞外基質變化是導致腎組織纖維化的主要原因，最終促進糖尿病腎病的發展[6]。Tripathi YB等學者研究表明[7]MMP-9降低時，ECM處于病理堆積狀態，從而導致糖尿病腎病的發展變化。因此，細胞外基質降解機制是研究重點。細胞外基質成分主要包括膠原蛋白、層粘連蛋白和彈性蛋白。細胞外基質屬于膠原蛋白家族，主要含Ⅲ和IV型膠原蛋白。內皮細胞和足細胞位于基底膜細胞外基質結構，主要是由IV型膠原組成。細胞外基質的降解涉及4 種蛋白水解酶，在腎組織中活性較強的鋅依賴性蛋白水解酶-金屬蛋白酶(matrix metalloprotein，MMps)。MMP-9是MMps家族的成員，基因位于染色體20q11.1～13.1，26～27kbp，具有13個外顯子和9個內含子，主要功能是降解和重塑細胞外基質[8-10]，且當MMP-9基因啟動子異常甲基化時，將可能導致糖尿病腎病細胞外基質代謝失衡[11]。研究表明，下調MMP-9的同時，上調金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMp-1)，以致MMP-9/TIMp-1比例失調，ECM降解減少，促進腎臟肥大及細胞外基質堆積[12]。Okada R等學者[13]研究發現在糖尿病腎病模型中，MMP-9在足細胞中高表達，且高塘環境可誘導體外培養的足細胞高表達MMP-9。本研究結果表明，當大鼠糖尿病腎病造模成功后，相較于模型組，紅景天苷組的MMp-9的表達水平上調，且足細胞數目增加、相關生化指標FPG、FINS、BUN、 Scr、24h mALB均有不同程度的下降，說明紅景天苷可延緩糖尿病腎病的發生發展。分析原因可能是紅景天苷通過上調MMp-9的表達水平，從而使得MMp-9在體內特異性降解IV型膠原，分解細胞外基質成分，增加糖尿病腎病的足細胞數目，達到改善糖尿病腎病損傷的治療作用。

紅景天苷(salidroside) 是從紅景天植物根、莖根中提取的主要有效酚苷類化合物，毒副作用比較小，現代藥理學研究表明具有明顯的抗氧化、降血糖、調血脂、預防骨質疏松等作用[14]。紅景天苷可明顯抑制大鼠腎小球基底膜增厚，從而參與腎臟局部的病理改變過程[15-16]。研究表明[17]紅景天苷能夠有效提高糖尿病大鼠胰島素分泌，有效降低空腹血糖和血脂水平，增加體質量。樸敏虎等[18]將紅景天苷干預治療鼠糖尿病腎病模型，結果顯示紅景天苷能降低模型組的血糖、血尿素氮、肌酐、白介素-1β、腫瘤壞死因子-α 及腎組織的丙二醛水平，明顯改善腎功能并發揮治療作用。武凱良等[19]在60例患者研究中發現紅景天苷不僅可以改善腎功能，而且可以影響糖尿病腎病患者血管內皮生長因子(VEGF)、熱休克蛋白70(HSp70)的表達，起到抗氧化應激的作用。本次實驗，相較于模型組和對照組，在紅景天苷藥物組作用下，糖尿病腎病的病理損害明顯得到改善，與紅景天苷的藥理作用相一致。

本實驗中發現，一方面，相對于糖尿病腎病模型組，給予紅景天苷干預后，伴隨MMp9表達水平的上升和足細胞數量上升，生化指標檢測表明FPG、FINS、BUN、 Scr、24h mALB會有不同程度的下降，主要是在FPG、BUN、Scr水平上差異有統計學意義；另一方面，不同劑量的紅景天苷組在FINS、mALB水平水平雖有差異，但差異無統計學意義。因此，說明此機制主要通過在降糖、降尿蛋白、改善大鼠胰島素水平和腎功能的損害等方面延緩糖尿病腎病的發展，但未必有劑量依賴性。

因此，紅景天苷通過上調MMP-9的表達水平可達到延緩糖尿病腎病進展。以后若從基因水平上分析MMP-9因子改變的根源，其作用機制將更加明確，便于更好地為臨床應用提供有效的依據。