化學物致癌性體外檢測方法研究進展

楊淼，強雨薇，周帆，張馳

(南京市產品質量監督檢驗院，江蘇 南京 210019)

0 引言

腫瘤是危害人民生命健康的最重要的公共衛生問題，在全球約2/3國家和地區前兩位的死亡原因都是腫瘤[1]。腫瘤的發生發展是一個正常細胞轉變為腫瘤細胞的多階段復雜過程，是遺傳因素和環境因素交互作用的結果，環境因素包括物理因素，化學因素和生物因素，其中化學因素占致癌因素的80%[2]，因此識別化學致癌物是腫瘤防控的首要環節。腫瘤的發生發展有很長的潛伏期，確定化學物是否具有致癌性需要漫長的觀察期。長期以來，判斷化學物是否致癌性的主要依據是哺乳動物長期致癌試驗和人群流行病學調查[3]。但這兩種方法耗時長、成本高、效率低、干擾因素多、無法反映致癌機制，難以滿足海量化學物大規模快速篩選需要，亟需開發高通量、低成本的體外檢測技術，以預測化學物的長期毒性效應，特別是致癌性?，F行的化學物致癌性篩選策略往往采取體內體外相結合的組合檢測策略，體外試驗是體內試驗的有效補充，大大縮小致癌體內測試的化學物數量。本文就化學物致癌性的體外檢測方法進行綜述，為化學物的致癌性的分層及組合篩選提供參考。

1 化學致癌物的分類及致癌機制

世界衛生組織國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)將包括單一及混合化學物、職業暴露、環境暴露、物理及生物因素和生活方式在內的致癌因素按照人類致癌性、實驗動物致癌性和致癌機制研究證據的權重進行分類。2019年，IARC將致癌因素的分類簡化為3類：第1類為人類致癌物，這類物質有充分的人類致癌性和實驗動物致癌性證據；第2類又分為很可能的人類致癌物(2A類)和可能人類致癌物(2B類)，2A類物質的人類致癌性證據有限，但在人源細胞或組織中觀察到充分的致癌性特征，且在實驗動物中致癌性證據充分，2B類物質也具有人類致癌性證據有限、實驗動物致癌性證據充分的要求，但不要求人源細胞或組織中有致癌證據；第三類為未分類物質，指那些動物實驗和人類致癌性證據均不足，或僅在實驗動物中有明確致癌性機制，人類致癌性證據不充分。截止至2020年11月28日，1類致癌因素共121種，2A類致癌因素89種，2B類致癌因素315種，3類為497種[4]。

化學致癌過程是一個復雜的多基因調控的多階段步驟。按照是否能直接損傷遺傳物質，化學致癌物可以分為遺傳毒致癌物(Genotoxic carcinogens，GC)和非遺傳毒致癌物(Nongenotoxic carcinogens，NGC)。GC指能直接作用于DNA，引起DNA損傷或染色體突變的致癌物，又稱為致突變物或誘變劑。遺傳毒致癌物作用于體細胞DNA形成DNA加合物，誘導染色體斷裂、融合、缺失、錯誤分離和不分離，引起基因組損傷和信號轉導異常，在此基礎上突變的細胞無限制地增殖，最終形成腫瘤[5]。常見的GC有苯并芘[6]、N-亞硝基二甲胺[7]、黃曲霉素B1[8]、砷[9]等。GC的檢測手段發展較成熟，可以通過一系列的遺傳毒性試驗進行檢測。根據檢測的遺傳學終點，檢測方法可以分為檢測基因突變類方法、檢測染色體和染色體組畸變類方法、檢測DNA損傷類方法。

NGC可以通過各種非損傷DNA的機制誘導腫瘤發生，致癌機制尚未闡明?，F有研究認為NGC的致癌機制可能與氧化應激、炎癥反應、內分泌調節、腫瘤促進、免疫抑制、表觀遺傳改變等有關[10]。已證實的非遺傳毒致癌物有：佛波酯[11]，苯巴比妥鈉[12]，石棉[13]等。NGC不直接作用于DNA并且作用機制復雜，無法采用傳統的遺傳毒性試驗檢測，尚無成熟的檢測體系。隨著對NGC致癌機制的深入研究，對NGC的檢測手段也越來越多。Huang[14]等利用體外細胞轉化實驗結合DNA甲基化檢測的方法檢測了包含DEHP在內的十種NGC。Schaap[15]等建立了基于小鼠干細胞的毒理基因組學方法，根據NGC特有的基因表達網絡區分GC和NGC。

2 化學物致癌性體外檢測方法

2.1 遺傳毒致癌物體外檢測方法

根據不同的毒理學檢測終點，發展出了不同的遺傳毒性體外檢測方法。各國相繼頒布了標準和法律法規來規范遺傳毒性檢測策略，體外檢測往往作為組合檢測策略的重要一環。近年來，經濟合作與發展組織(Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)發布并修訂了一批遺傳毒性檢測方法，目前OECD認可的遺傳毒性體外檢測試驗指導原則共10個(TG 471-TG 473，TG 476，TG 479- TG 482，TG 487，TG 490)(https://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicalssection-4-health-effects_ 20745788)。美國環保署(U.SEnvironmentalProtectionAgency，EPA)也制定了一系列有毒物質的毒性檢測指南，其中遺傳毒性體外檢測試驗共8個(OPPTS 870.5100，OPPTS 870.5140，OPPTS 870.5250，OPPTS 870.5300，OPPTS 870.5375，OPPTS 870.5500，OPPTS 870.5575，OPPTS 870.5900)。我國衛生部于2005年頒布了《化學品毒性鑒定技術規范》，規范中規定了化學物的毒性檢測策略，其中就包含了遺傳毒性體外檢測步驟和方法。中國檢驗檢疫科學研究院針對OECD的測試準則，建立了部分遺傳毒性體外檢測方法標準(表1)。下面針對不同遺傳終點的代表性檢測方法進行簡述。

表1 國內外遺傳毒性體外檢測方法比較

細菌回復突變試驗(Ames試驗)是應用最廣泛的檢測化學物誘導基因突變的體外方法，包括鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗和大腸桿菌回復突變試驗[16]。檢測原理為組氨酸營養缺陷型菌株在具有誘變毒性的化學物作用下可以回復成野生型，形成肉眼可見的菌落，生成野生型菌株的概率與遺傳毒物間存在劑量-反應關系。Ames試驗中選用的菌株與檢測的突變類型有關，TA1535，TA100，WP2 uvrA，TA102用于檢測堿基置換型突變，TA1537，TA97，TA98用于檢測移碼型突變[17]。Ames試驗的優勢在于體系成熟，操作簡單，試驗周期短。缺點是少數不在肝臟中代謝的化學物無法通過Ames試驗檢測其突變性，部分本身有較深顏色的物質如中藥，可能會影響菌落的計數。

染色體異常是DNA損傷的直接表現，微核試驗是檢測染色體異常的首選方法。在遺傳毒致癌物的作用下，染色體丟失或斷裂形成的染色體片段在有絲分裂的中后期滯留在細胞質中成為微核，微核數量反映了遺傳毒性大小[18]。傳統的微核試驗采用染色后高倍鏡下計數的方法計算微核數量，存在一定的主觀性。隨著技術進步，科研工作者也對體外微核試驗進行了優化和改進。有研究將流式細胞術與微核試驗相結合，與顯微鏡觀察相比，流式細胞術分析微核形成率具有高通量，客觀和自動化的優勢[19]。在使用的細胞載體上也有創新，傳統的體外微核試驗主要使用CHO、V79、淋巴瘤細胞等細胞，在對化妝品進行體外微核試驗時，為了更好地模擬化妝品的暴露途徑，開發了基于3D重組人工皮膚模型的微核試驗，試驗表現出了對遺傳毒致癌物良好的預測能力[20]。

檢測遺傳毒性的另一個重要方法是直接檢測DNA損傷，常見的檢測技術有：彗星試驗，熒光原位雜交，TUNEL，8-OHdG等。彗星試驗，又稱為單細胞凝膠電泳，是應用最廣泛的檢測DNA鏈斷裂的體外方法。當DNA在遺傳毒致癌物作用下發生鏈斷裂時，在電場作用下，分子量大的核DNA移動速度慢，而斷裂的DNA片段移動速度快，形成拖尾類似“彗星”[21]。到目前為止，彗星試驗已在超過300個環境和職業暴露研究中應用[22]。有研究利用彗星實驗發現了包含農藥硫丹[23]、苯及苯代謝物[24]、除草劑[25]在內的多種DNA損傷劑。近期的研究擴展了體外彗星試驗常用的細胞株，Amaya[26]等比較了12種化學物分別在HepG2，CHL/IU，TK6細胞株上的表現，發現HepG2細胞是最適宜的體外彗星試驗細胞載體。

2.2 非遺傳毒致癌物的體外檢測方法

如前文所述，非遺傳毒致癌物的體外檢測一直是致癌物檢測的難點和薄弱環節。原因在于a)非遺傳毒致癌物不直接作用于DNA，無法應用常規的遺傳毒試驗檢測；b)非遺傳毒致癌物的作用機制復雜，不同的致癌物適用不同的檢測方法；c)非遺傳毒致癌物產生的早期毒性反應多為非特異改變；因此通過體外方法檢測非遺傳毒致癌物較為困難。

現有研究發現雖然NGC不直接以DNA為作用靶點，但也可能通過間接途徑影響DNA復制、RNA轉錄及蛋白的翻譯，產生遺傳毒效應，因此部分NGC也可以采用改良的遺傳毒試驗檢測，其中體外細胞轉化試驗(in vitro cell transformation assay，CTL)是目前最佳的NGC體外檢測方案。CTL模擬了體內多階段的致癌步驟，在區分GC和NGC、解釋致癌物在腫瘤發展不同階段的作用機制等方面有重要優勢[27]。Sasaki[28]等將V-Ha-ras基因轉染BALB/c 3T3細胞，建立了Bhas 42細胞。利用Bhas 42細胞，Muramatsu[29]等發現了砷主要發揮腫瘤促進的非遺傳毒性。OECD在2016年發布了以Bhas 42細胞為基礎的兩階段細胞轉化試驗的指導原則[30]。此外，Kanode[31]等利用TA98菌株應用Ames試驗準確地檢出了四種非遺傳毒致癌物。雖然國內國外多個課題組建立了許多NGC的體外測試方法，但只有CTL法被充分驗證，要建立一整套的非遺傳毒檢測方法體系還有很長的路要走。

2.3 致癌性體外檢測方法的最新進展

組學技術在近二十年蓬勃發展，組學技術應用于毒理學領域融合成為毒理基因組學，毒理基因組學為致癌物篩選開拓了新的思路和方法，發現了一批致癌相關生物標志，為致癌物暴露早期評估及高危人群保護提供理論依據。有研究將9種遺傳毒致癌物和7種非遺傳毒致癌物處理HepG2細胞，對處理后的細胞進行了cDNA芯片分析，篩選出了一批差異表達基因，對表達差異前20位的基因進行集合分析，發現基于不同表達特征的基因可準確篩選出遺傳毒致癌物和非遺傳毒致癌物[32]。Kawata[33]等在HepG2細胞中評估了致癌物砷、鎘、鉻、二甲基亞硝胺、佛波酯、四氯乙烯作用下共同基因表達模式，發現癌基因PTTG1可能是致癌物的分子機制上的關鍵分子。Li[34]等分析了330個化學物在HepG2細胞上的基因表達譜，集合中包含～6000個基因的表達水平，采用隨機森林分類法篩選出了基于芳烴受體(AhR)通路的致癌機制。表觀遺傳調控近年來成為腫瘤研究的熱門，miRNA是表觀遺傳調控主要方式之一，最新研究發現miRNA也可以作為致癌物暴露的生物標志。例如，用BaP處理人支氣管上皮細胞后，表達上調的有miR-106a、miR-129、miR-494、miR-498、miR-320，表達下調的有miR-10a、miR-363、miR-493[35]。但組學技術在致癌物篩選中仍有很長的路要走，基于高通量篩選發現的新生物標志和致癌機制尚處于前期研究及驗證階段，這些方法與致癌性之間的關聯度有待長期考察。

計算毒理學借助數學模型，根據化學物的化學結構、已知毒理學測試數據和環境暴露數據，實現對未知毒性化學物的毒性預測，已成為大批量化合物毒性預測的首選方法[36]。定量構效關系(Quantitative Structure-activity Relationship，QSAR)模型是計算毒理學中最常見的模型，市面上已有若干商業QSAR平臺軟件，包括歐盟開發的Toxtree，OECD開發的Toolbox，Accelrys公司開發的TOPKAT，美國EPA開發的T.E.S.T.，Lhasa公司開發Derek等。其中，能預測致癌性的QSAR平臺是Toxtree，Toolbox，TOPKAT，Derek。Morales[37]等應用QSAR模型，預測了62個硝基化合物的致癌性。Wedebye[38]等應用16種QSAR預測模型預測了70983種REACH關注物質的遺傳毒致癌性，致突變性和發育毒性，結果發現6.5%的化學物具有遺傳毒致癌性，16.3%的化學物有致突變性，11.5%為發育毒性物質，與已知的毒理測試數據類似。美國FDA針對膳食中的潛在致癌風險物質開發了計算構效關系模型，以預測有機成分和天然成分的致癌風險，結果發現了19種膳食成分有致癌潛力。此外，這套預測系統也用于預測其他化學物，迄今為止已預測了超過1200種藥物，工業化學品和天然產物，預測性能表現良好[39]。但計算毒理學在化學物致癌性預測上也面臨困境，以QSAR為代表的預測方法的基礎是化學結構，但致癌性是一個相對復雜的評價終點，致癌物往往作用于多個靶點影響多條分子信號通路，現有的模型構建方法識別出致癌物的效能較低。

3 小結

化學物致癌性體外檢測的難點主要在于由于致癌機制的復雜性導致單一試驗手段預測效能低下，以及海量新化學品帶來的篩選壓力。將經典試驗方法結合高通量技術，制定組合檢測策略，采用基于計算毒理學思想預測具有特征結構的化學物毒性或在新致癌機制理論指導下的試驗技術對化學物致癌性進行預測和評價將成為可行的解決辦法。目前，大多數經典的遺傳毒體外試驗都可通過結合流式細胞術、高內涵技術或改變計算指標的方法實現自動化和高通量化，部分已被OECD、EPA、FDA等制定為毒性檢測指導原則，但非遺傳毒體外測試仍處于測試和驗證階段，深入研究化學物的致癌機制將有助于測試方法的開發。此外，組合檢測策略已經成為致癌性體外檢測的主要趨勢，在化妝品、藥品、食品等領域已分別制定了相應的檢測規范。本文梳理了化學物遺傳毒性和非遺傳毒性的試驗方法，為致癌性檢測和評價提供借鑒思路。