番石榴葉乙醇提取物的化學(xué)成分研究

陳欣怡，黃積武，李創(chuàng)軍，馬潔，臧應(yīng)達，張東明

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，北京 100050)

番石榴(PsidiumguajavaLinn.)為桃金娘科(Myrtaceae)番石榴屬(Psidium)植物，原產(chǎn)于美洲熱帶，在我國廣東、廣西、福建等省均有栽培[1]。番石榴中化學(xué)成分種類豐富，近年來研究發(fā)現(xiàn)，番石榴中含有混源萜、三萜、黃酮、鞣質(zhì)、胡蘿卜素等多種類型的化合物[2]。番石榴葉及果實具有一定的食用價值，同時也具有出色的藥用價值。目前藥理研究表明，番石榴具有降血糖[3]、降血脂[3]、抗菌[4]、抗病毒[5]、抗炎[6]、抗腫瘤[7]、肝保護[8]等多種藥理作用。為了充分開發(fā)利用番石榴葉的藥用價值，對番石榴葉的化學(xué)成分進行了研究，從中分離鑒定了十個化合物，分別為:guajadial(1)、psiguajadial G(2)、guajadial C(3)、psiguajadial E(4)、physcion(5)、4-methoxy-6-phenyl-2H-pyran-2-one(6)、(6S,8R)-loliolide(7)、teuhetenone A(8)、(R)-(-)-mellein methyl ether(9)、2-羥基苯甲酸芐酯(10)。化合物結(jié)構(gòu)見圖1。化合物1～4為混源萜類化合物，5～10為首次從番石榴葉中分離得到。

圖1 化合物1～10結(jié)構(gòu)

1 樣品來源與鑒定

藥材采摘自廣西壯族自治區(qū)桂林市，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所馬林副研究員鑒定為番石榴(PsidiumguajavaL.)葉。標(biāo)本保存在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所標(biāo)本室(ID-22163)。

2 儀器與材料

2.1 儀器 Buchi Rotavapor R-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Themo Q Exactive Focus組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀；Bruker AVANCE-III 500 MHz核磁共振波譜儀；Bruker AVANCE-III HD 600 MHz核磁共振波譜儀；Agilent 1100型高效液相色譜；Buchi C-600中壓液相色譜儀；Shimadzu LC-16P雙波長制備液相色譜；Agilent Xcalibur Eos Gemini X射線單晶衍射儀。

2.2 材料 ODS填料(北京金歐亞科技發(fā)展有限公司和北京慧德易)；硅膠板(煙臺化學(xué)工業(yè)研究所)；乙腈和甲醇(色譜純，美國Fisher、TEDIA公司)；有機試劑：石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇、乙醇、甲醇等(均為國產(chǎn)分析純)。

3 提取和分離

取番石榴干燥葉40 kg，粉碎過篩后，用95%乙醇進行加熱回流提取兩次，合并95%乙醇提取液，過濾并減壓得到浸膏。浸膏加水用二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮蒸干，得到浸膏3.0 kg，將浸膏與4.0 kg硅膠拌樣后，進行硅膠柱層析，依次用石油醚(30 L)、石油醚-丙酮混合溶劑(20∶1、5∶1各30 L)、二氯甲烷-甲醇(1∶1，20 L)混合溶劑進行洗脫，分別得到Fr.1～4。

組分Fr.1(320 g)經(jīng)聚酰胺柱(乙醇∶水50∶50→95∶5)洗脫，最后用石油醚沖柱，得到Fr.1A～Fr.1D，F(xiàn)r.1B經(jīng)硅膠柱(環(huán)己烷∶二氯甲烷7∶1→0∶1)洗脫，最后用二氯甲烷∶甲醇=1∶1沖柱，得到Fr.1B1～Fr.1B8，F(xiàn)r.1B3經(jīng)ODS制備柱、ODS半制備柱純化得到化合物10(7 mg)。Fr.1B5用中壓液相色譜分離，用甲醇-水體系進行梯度(88∶12→100∶0)洗脫，得到Fr.1B51～Fr.1B548，F(xiàn)r.1B547析出無色針狀晶體(27 mg)，過濾后用氯仿-甲醇溶劑(1∶1)重結(jié)晶，得到無色塊狀晶體為化合物1。Fr.1B6進行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯體系進行梯度(50∶1→2∶1)洗脫，得到Fr.1B61～Fr.1B634，F(xiàn)r.1B65經(jīng)制備液相色譜進行純化(纖維素-4手性半制備柱)，得到化合物3(3 mg)。Fr.1B68用纖維素-4手性半制備柱分離，再用苯基制備柱純化，得到化合物2(1.0 mg)和化合物4(6.0 mg)。

組分Fr.2(400 g)經(jīng)MCI柱(乙醇∶水 60∶40→95∶5)洗脫，后又經(jīng)硅膠柱(石油醚∶丙酮50∶1 → 10∶1)洗脫，后經(jīng)ODS制備柱、ODS半制備柱純化得到化合物5。

組分Fr.3(230 g)經(jīng)MCI柱(甲醇∶水10∶90→100∶0)洗脫，得到Fr.3A～Fr.3H。Fr.3D(11.7 g)經(jīng)硅膠柱(環(huán)己烷∶二氯甲烷4∶1→1∶1)洗脫，得到Fr.3D1～Fr.3D14，F(xiàn)r.3D3+4經(jīng)開放ODS制備柱，用甲醇-水進行梯度(40∶60→100∶0)洗脫，得到Fr.3D3-1～Fr.3D3-17。Fr.3D3-5(114 mg)用制備液相色譜分離(ODS制備柱)，用ODS半制備柱純化，得到化合物6～9。

4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色塊狀晶體(氯仿∶甲醇=1∶1)，HRESIMSm/z475.247 8([M +H]+,C30H35O5,計算值 475.247 9),[α]20 D=-8.8(c0.6,丙酮)、[α]20 D=-30.1(c0.375,氯仿)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：1.01(3H,s,H-12)，0.98(3H,s,H-13)，1.26(3H,s,H-14)，4.54(1H,s,H-15a)，4.04(1H,s,H-15b)，10.09(1H,s,H-14′)，10.06(1H,s,H-15′)，13.44(1H,s,H-5′-OH)，13.05(1H,s,H-7′-OH)，7.12(2H,d,J=7.5 Hz,H-10′/12′)，7.18(1H,s,H-11′)，7.24(2H,m,H-9′/13′)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：41.3(C-1)，53.2(C-2)，22.2(C-3)，37.1(C-4)，84.3(C-5)，43.4(C-6)，30.4(C-7)，35.4(C-8)，150.6(C-9)，36.7(C-10)，33.8(C-11)，30.4(C-12)，22.0(C-13)，21.2(C-14)，110.2(C-15)，43.4(C-1′)，105.5(C-2′)，163.4(C-3′)，104.1(C-4′)，168.3(C-5′)，104.3(C-6′)，169.5(C-7′)，143.7(C-8′)，128.7(C-9′/13′)，127.9(C-10′/12′)，126.1(C-11′)，192.0(C-14′)，191.5(C-15′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的guajadial[2]一致。此外，化合物1在氯仿-甲醇混合溶劑(1∶1)中培養(yǎng)得到高質(zhì)量單晶，經(jīng)X-射線單晶衍射方法進一步確證了化合物1的絕對構(gòu)型(見圖2)，晶體尺寸：0.280×0.250×0.240 mm3。銅靶輻射波長 (λ=1.541 84 ?)。衍射點收集9 751。獨立衍射點4 232[Rint=0.023 0 (inf-0.9?)]，空間群P21，晶胞棱邊長a=6.544 2(3) ?,b=17.482 7(7) ?,c=10.671 6(4) ?，晶胞棱間夾角α=90°,β=90.618(4)°,γ=90°，單斜晶，T=111.3(2) K。對于可觀測衍射點的殘差因子R值 [I> 2σ(I)],R1=0.074 4,wR2=0.189 7。對于全部衍射點的殘差因子R：R1=0.075 4,wR2=0.190 9。Flack常數(shù) 0.02(9)。晶體完整性0.998 7。CCDC號: 1966573。

圖2 化合物1的X-單晶衍射圖

化合物2：白色粉末，HRESIMSm/z497.230 2([M + Na]+,C30H34O5Na，計算值 497.229 8)，[α]20 D =-23.0(c0.1,氯仿)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：0.99(3H,s,CH3-12)，0.96(3H,s,CH3-13)，1.05(3H,s,CH3-14)，4.89(1H,s,H2-15a)，4.81(1H,s,H2-15b)，7.11(1H,d,J=7.0 Hz)，7.23(3H,m)，10.11(1H,s,H-14′)，10.15(1H,s,H-15′)，13.63(1H,s,H-5′-OH)，13.21(1H,s,H-7′-OH)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：42.6(C-1)，57.8(C-2)，23.2(C-3)，42.3(C-4)，86.1(C-5)，39.0(C-6)，27.7(C-7)，36.1(C-8)，154.2(C-9)，37.6(C-10)，33.5(C-11)，29.6(C-12)，22.6(C-13)，22.9(C-14)，110.3(C-15)，35.8(C-1′)，103.7(C-2′)，164.2(C-3′)，103.8(C-4′)，103.7(C-5′)，103.6(C-6′)，168.8(C-7′)，139.2(C-8′)，130.2(C-9′)，127.8(C-10′)，126.7(C-11′)，127.8(C-12′)，130.2(C-13′)，191.5(C-14′)，192.2(C-15′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的psiguajadial G[1]一致，故鑒定化合物2為psiguajadial G。

化合物3：淡黃色粉末，HRESIMSm/z475.247 6([M + H]+,C30H35O5，計算值 475.247 9)，[α]20 D=+126.0(c0.2,氯仿)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：0.58(3H,d,J=6.0 Hz,CH3-12)，0.88(3H,d,J=6.0 Hz,CH3-13)，0.91(3H,d,J=7.0 Hz,CH3-15)，5.34(1H,s,H-2)，7.15(2H,d,J=7.0 Hz )，7.21(1H,m,1H)，7.28(2H,m)，10.11(1H,s,H-14′)，10.12(1H,s,H-15′)，13.57(1H,s,H-5′-OH)，13.16(1H,s,H-7′-OH)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：78.1(C-1)，125.5(C-2)，147.9(C-3)，50.6(C-4)，22.1(C-5)，28.7(C-6)，33.1(C-7)，37.7(C-8)，22.0(C-9)，30.9(C-10)，27.0(C-11)，21.5(C-12)，21.2(C-13)，43.7(C-14)，14.3(C-15)，34.6(C-1′)，102.8(C-2′)，164.6(C-3′)，104.6(C-4′)，168.6(C-5′)，104.1(C-6′)，169.8(C-7′)，144.7(C-8′)，126.8(C-9′)，128.6(C-10′)，126.3(C-11′)，128.6(C-12′)，126.8(C-13′)，192.4(C-14′)，191.6(C-15′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的guajadial C[1]一致，故鑒定化合物3為guajadial C。

化合物4：無色油狀物，HRESIMSm/z497.230 4([M + Na]+,C30H34O5Na，計算值 497.229 8)，[α]20 D =-109.0(c0.2,氯仿)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：1.23(3H,s,CH3-12)，1.17(3H,s,CH3-13)，1.13(3H,s,CH3-14)，1.08(3H,s,CH3-15)，4.90(1H,d,J=8.5 Hz,H-1)，10.07(1H,s,H-14′)、10.19(1H,s,H-15′)，13.74(1H,s,H-5′-OH),13.05(1H,s,H-7′-OH)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：127.1(C-1)，131.3(C-2)，37.7(C-3)，23.4(C-4)，32.7(C-5)，28.5(C-6)，80.0(C-7)，40.9(C-8)，40.0(C-9)，24.3(C-10)，19.4(C-11)，19.9(C-12)，30.5(C-13)，26.1(C-14)，18.1(C-15)，48.6(C-1′)，105.7(C-2′)，163.0(C-3′)，103.6(C-4′)，168.6(C-5′)，104.0(C-6′)，168.8(C-7′)，142.8(C-8′)，128.7(C-9′)，126.9(C-10′)，126.9(C-11′)，126.9(C-12′)，128.7(C-13′)，192.7(C-14′)，191.4(C-15′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的psiguajadial E[1]一致，故鑒定化合物4為psiguajadial E。

化合物5：橙色粉末，HRESIMSm/z283.061 5([M-H]-,C16H11O5，計算值 283.061 2)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：12.45(3H,s,CH3-15)，3.94(3H,s,CH3-16)，7.08(1H,s,H-2)，7.63(1H,s,H-4)、7.37(1H,d,J=2.0 Hz,H-5)，6.69(1H,d,J=2.0 Hz,H-7)，12.31(1H,s)，12.11(1H,s)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：162.5(C-1)，124.5(C-2)，148.4(C-3)，121.3(C-4)，108.2(C-5)，166.5(C-6)，106.8(C-7)，165.2(C-8)，190.8(C-9)，182.0(C-10)，133.2(C-11)，113.7(C-12)，110.2(C-13)，135.2(C-14)，22.2(C-15)，56.1(C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的physcion[2]一致，故鑒定化合物5為physcion。

化合物6：無色柱狀晶體，HRESIMSm/z203.070 3([M + H]+,C12H11O3，計算值203.070 3)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：3.87(3H,s,CH3-1′′)]，5.55(1H,s,H-3)，6.43(1H,s,H-5)，7.81(2H,s,H-2′/H-6′)，7.46(3H,overlap,H-3′/H-4′/H-5′)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：164.2(C-2)，88.5(C-3)，171.3(C-4)，98.0(C-5)，160.2(C-6)，131.1(C-1′)，125.7(C-2′)，128.9(C-3′)，131.0(C-4′)，128.9(C-5′)，125.7(C-6′)，56.0(C-1′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的4-methoxy-6-phenyl-2H-pyran-2-one[2]一致，故鑒定化合物6為4-methoxy-6-phenyl-2H-pyran-2-one。

化合物7：無色方晶(氯仿)，HRESIMSm/z197.117 3([M + H]+,C11H17O3，計算值 197.117 2)，[α]20 D =-93.3(c0.445,氯仿)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：1.27(3H,s,CH3-9)，1.47(3H,s,CH3-10)，1.79(3H,s,CH3-11)，5.69(1H,s,H-2)。13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δC：182.8(C-1)，112.8(C-2)，172.1(C-3)，36.0(C-4)，45.6(C-5)，66.7(C-6)，47.3(C-7)，86.9(C-8)，30.7(C-9)，26.5(C-10)，27.0(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的(6S,8R)-loliolide[12]一致。此外，化合物7在氯仿中培養(yǎng)得到單晶，經(jīng)X-射線單晶衍射方法進一步確證了化合物7的絕對構(gòu)型(見圖3)，晶體尺寸：0.410×0.370×0.230 mm3。銅靶輻射波長(λ=1.541 84 ?)。衍射點收集3 059。獨立衍射點1 915 [Rint=0.023 6 (inf-0.9?)]，空間群P21，晶胞棱邊長a=5.993 6(11) ?,b=11.574 4(14) ?,c=7.812(2) ?，晶胞棱間夾角α=90°,β=190.10(2)°,γ=90°，單斜晶，T=111(4) K。對于可觀測衍射點的殘差因子R值 [I> 2σ(I)],R1=0.036 6,wR2=0.092 8。對于全部衍射點的殘差因子R值：R1=0.038 3,wR2=0.094 4。Flack常數(shù)0.03(15)。晶體完整性0.999 0。CCDC號: 2072802。

圖3 化合物7的X單晶衍射圖

化合物8：無色油狀物，HRESIMSm/z195.138 0([M + H]+,C12H19O2，計算值 195.138 0)，[α]20 D=+110.9(c0.23,氯仿)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：1.32(3H,s,CH3-11)，1.43(3H,s,CH3-12)，6.35(1H,s,H-2)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：200.4(C-1)，122.5(C-2)，175.0(C-3)，72.4(C-4)，42.5(C-5)，19.5(C-6)，40.6(C-7)，36.2(C-8)，34.0(C-9)，40.9(C-10)，29.6(C-11)，24.5(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的teuhetenone A[1]一致，故鑒定化合物8為teuhetenone A。

化合物9：白色粉末，HRESIMSm/z193.085 9([M + H]+,C11H13O3，計算值193.085 9)，[α]20 D =-190.0(c0.031 5,氯仿)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：1.48(3H,d,J=6.0 Hz,CH3-10)]，3.95(3H,s,CH3-11)，6.92(1H,d,J= 8.0 Hz,H-4)，7.45(1H,d,J= 8.0 Hz,H-5)，6.80(1H,d,J= 8.0 Hz,H-6)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：162.7(C-1)，113.7(C-2)，161.2(C-3)，110.9(C-4)，134.4(C-5)，119.1(C-6)，141.0(C-7)，36.1(C-8)，74.1(C-9)，20.7(C-10)，56.2(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的(R)-(-)-mellein methyl ether[1]一致，故鑒定化合物9為(R)-(-)-mellein methyl ether。

化合物10：油狀物，HRESIMSm/z229.085 9([M + H]+,C14H13O3，計算值229.085 9)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：10.76(1H,s,C-2-OH)，6.99(1H,dd,J=8.0,1.0 Hz,H-3)，7.46(1H,m,H-4)，6.87(1H,td,J=8.0,1.0 Hz,H-5)，7.89(1H,dd,J=8.0,1.0 Hz,H-6)，7.45(1H,m,H-2′/H-6′)，7.41(3H,overlap,H-3′/H-4′/H-5′)。13C-NMR(CDCl3，125 MHz)δC：112.3(C-1)，161.7(C-2)，117.6(C-3)，135.8(C-4)，119.2(C-5)，130.0(C-6)，169.9(C-7)，135.3(C-1′)，128.3(C-2′)，128.5(C-3′)，128.7(C-4′)，128.5(C-5′)，128.3(C-6′)，67.0(C-7′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的2-羥基苯甲酸芐酯[15]一致，故鑒定化合物10為2-羥基苯甲酸芐酯。

5 討論

本次實驗從番石榴葉中共分離鑒定10個化合物，其中化合物1～4為混源萜類化合物，化合物1、7得到單晶，并通過X-射線單晶衍射方法確證了它們的絕對構(gòu)型。番石榴提取物具有多種藥理作用，對番石榴葉的化學(xué)成分研究具有重要意義，從番石榴葉中得到的單體化合物藥理活性還有待進一步研究。