丹皮酚預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

趙輝，趙偉，李素霞，王衛華，于淼

(1．菏澤醫學專科學校，山東 菏澤 274000；2．菏澤市立醫院，山東 菏澤 274013)

近年來缺血性腦卒中的發病率越來越高，嚴重威脅著人類的生命健康，腦缺血再灌注后繼發性損傷對該類疾病的進展有著較大的影響，細胞凋亡是腦缺血再灌注后繼發性損傷的主要原因[1-2]。研究發現，熱休克蛋白(Hsp-70)、凋亡相關蛋白(Bcl-2、Bax)與細胞凋亡有著密切的關系。腦缺血前給予藥物預處理，在一定程度上可以減輕缺血再灌注損傷。丹皮酚是中藥牡丹皮的主要活性成分，除了具有抗癌、保肝、神經保護、抗菌消炎、保護心血管等作用外，還具有腦保護作用[3]，但其作用機制尚無定論。本實驗通過頸外動脈線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，以藥物預處理為出發點，觀察丹皮酚對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，為臨床上預防和治療缺血性腦卒中提供理論依據和治療思路。

1 材料

1.1 儀器 電熱恒溫水浴鍋(DK-S26型，上海精宏實驗設備有限公司)；自動雙重純水蒸餾儀(德SZ-93型，重慶光學儀器廠)；電子天平(BS 110S X型)、電子pH計(DELTA 320型)(德國Mettler Toledo公司)；DC200圖像采集系統、Image-proplus5.0醫學圖像分析軟件、光學顯微鏡、包埋機、切片機(德國Leica公司)；柯達圖像分析系統(美國柯達公司)；低溫高速離心機(美國BeekmanCoulter公司)。

1.2 藥品與試劑 丹皮酚注射液(上海第一生化藥業公司，批號：171201)；氯化三苯基四氮唑(TTC)、原位細胞凋亡檢測(TUNEL)試劑盒、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、兔抗鼠Hsp-70、Bcl-2、Bax抗體(武漢博士德有限公司)。

1.3 實驗動物 3個月健康雄性SD大鼠60只，體重250～280 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SYXK(京)2017-0012。動物飼料、飲用水均消毒處理，室內溫度、濕度恒定。

2 方法

2.1 分組與腦缺血再灌注損傷模型的制備 60只SD大鼠隨機均分成3組，每組20只。造模前12 h，藥物預處理組給予丹皮酚(100 mg·L-1)，模型組和假手術組給予等量生理鹽水，均采用腹腔注射。模型組和丹皮酚預處理組采用頸外動脈線栓法并加以改良制作腦缺血再灌注損傷模型[4]。手術前大鼠禁食禁水10～12 h，腹腔注射10%水合氯醛(1 mL·kg-1)麻醉，將麻醉大鼠仰臥位固定于實驗臺上，頸部脫毛，切開頸部皮膚，分離出左側頸總動脈、翼顎動脈、頸內動脈和頸外動脈，并將頸總動脈、翼顎動脈和頸外動脈結扎，同時在頸總動脈上切一個小口，采用直徑約0.25 mm的高彈力碳素魚線作為線栓，將線頭蘸蠟制成約0.25 mm的光滑線頭，然后蘸取肝素，從切口處輕柔推進插入線栓，使其沿頸內動脈入顱，進線約16～18 mm后如感到阻力即停止推送線栓，阻塞左側大腦中動脈。血流阻斷2 h后拔出線栓恢復血流，形成再灌注損傷模型。假手術組大鼠不結扎大腦中動脈血管，未做再灌注損傷處理。

2.2 神經功能評分 造模成功后，待大鼠清醒，按照Bederson評分標準進行神經功能缺損評分。具體評分標準如下：0級(0分)―大鼠無神經功能障礙；1級(1分)―提大鼠尾部，可見癱瘓側肢體屈曲困難不能正常伸向地面；2級(2分)―除1級癥狀外，推癱瘓側肢體時感覺阻力較另一側明顯減輕；3級(3分)―除1級癥狀外，大鼠在爬行時不自主地向癱瘓側旋轉；4級(4分)：大鼠伴有意識障礙。評分為0分、4分或死亡動物剔除，評分為1～3分，無蛛網膜下腔出血的動物才可進行實驗。

2.3 標本采集 造模成功后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉，將麻醉大鼠固定于手術臺上，剪開胸腔露出心臟。采用心臟灌注固定方法取腦，制備約5 μm 厚度石蠟切片，用于檢測大鼠腦梗死體積、海馬細胞凋亡及Hsp-70、Bcl-2、Bax表達。

2.4 TTC染色法檢測大鼠腦梗死體積 將腦組織切片用TTC進行染色，正常腦組織染成紅色，梗死腦組織染成白色。然后將腦組織切片用甲醛的磷酸鹽緩沖液固定。隨后用計算機圖像軟件掃描腦組織切片，測量大鼠的腦梗死面積，進而換算出大鼠的腦梗死體積。

2.5 TUNEL法檢測海馬細胞凋亡 切片經TUNEL混合液37 ℃孵育2 h；POD轉化劑37 ℃轉化40 min后磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗；DAB顯色；蘇木精復染；脫水、二甲苯透明后封固切片。每張切片在400倍顯微鏡下取海馬CA1區大致相同部位的6個互不重疊視野，觀察并計數凋亡細胞數，凋亡細胞細胞核呈棕黃色染色。

2.6 免疫組化染色法檢測海馬細胞Hsp-70、Bcl-2及Bax蛋白的表達 大鼠造模成功后取尾狀核平面切片，按常規免疫組化技術及試劑說明書要求分別進行Hsp-70、Bcl-2及Bax抗體染色。然后在光鏡下觀察，HSP-70陽性細胞位于細胞質與細胞核中，均呈藍色，尤其以細胞核周圍最為明顯。Bcl-2及Bax陽性細胞僅位于細胞質，Bcl-2陽性細胞呈褐色或者棕黃色，均勻彌漫樣染色；Bax陽性細胞呈藍色，核淡染色；每張切片在400倍光鏡下取出血灶邊緣相互不重疊的6個視野，觀察并計數切片的陽性細胞總數量。

3 結果

3.1 各組大鼠神經功能缺損和腦梗死體積比較 腦缺血再灌注損傷后，模型組及丹皮酚預處理組大鼠出現神經功能缺損、梗死灶等表現。與模型組比較，丹皮酚預處理組大鼠神經功能評分和腦梗死體積明顯減少(P<0.05)，結果見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分和腦梗死體積

3.2 各組大鼠海馬組織細胞凋亡水平比較 假手術組大鼠大腦皮質區域內未見TUNEL陽性細胞。腦缺血再灌注損傷后，模型組及丹皮酚預處理組大鼠腦缺血再灌注周圍皮質區域內出現TUNEL陽性細胞。與模型組比較，丹皮酚預處理組TUNEL陽性細胞數明顯減少(P<0.05)，結果見表2、圖1。

A.模型組TUNEL陽性細胞數；B.丹皮酚預處理組TUNEL陽性細胞數

3.3 各組大鼠HSP-70、Bcl-2及Bax陽性細胞數比較 腦缺血再灌注損傷后，模型組及丹皮酚預處理組海馬細胞周圍Bcl-2、Bax、Hsp-70陽性細胞數發生了變化。與模型組比較，丹皮酚預處理組Bax陽性細胞數明顯減少，Hsp-70及Bcl-2陽性細胞數明顯增加(P<0.05)，結果見表2、圖2。

表2 各組大鼠Hsp-70、Bcl-2、Bax陽性細胞數(n=10，個/視野，

圖2 各組大鼠Hsp-70、Bcl-2、Bax陽性細胞數(免疫組化染色，×400)

4 討論

缺血性腦血管病尤其是腦缺血后再灌注損傷對身體危害極大，腦缺血后局部血流受阻可導致腦細胞迅速死亡，快速恢復缺血部位腦組織的血供是防止腦細胞損傷的首要條件，但是再灌注之后恢復血流同時也可能會進一步加重缺血性損傷，即缺血再灌注損傷[5]。細胞凋亡在缺血再灌注損傷中起著重要作用。目前研究的熱點是通過減輕神經細胞凋亡，從而達到治療的目的[6]。研究發現，Hsp-70、Bcl-2及Bax與細胞凋亡有著密切的關系。Bcl-2與Bax是一組調控細胞凋亡的競爭性蛋白，Bcl-2具有抑制細胞凋亡、促進細胞存活的作用；Bax具有促進細胞凋亡及死亡的作用，Bax減少或Bcl-2增多均可能與神經細胞凋亡有關[7]。Hsp-70是一類應激性保護蛋白。在腦缺血情況下，Hsp-70可作為應激反應的一個可靠標志物，其神經保護作用可能與抑制細胞凋亡、促進蛋白質正確折疊等作用有關；另外，Hsp-70還可以維持細胞內環境的穩定、提高神經組織對腦缺血的耐受。現已公認Hsp-70為腦缺血性損傷中具有保護作用的蛋白，在促進腦細胞修復、腦缺血損傷恢復等過程中起著重要作用[8]。

丹皮酚又稱牡丹酚，是毛茛科植物牡丹根皮的主要有效單體成分。具有抗癌、保肝、神經保護、抗菌消炎、保護心血管等藥理作用。作為具有多種藥理作用的傳統中藥，逐漸引起醫藥界的重視。已有文獻報道，丹皮酚通過抑制興奮性氨基酸的毒性作用，抗自由基缺損，阻止鈣離子內流等機制對腦缺血具有一定的保護作用[9-11]。本實驗結果顯示，腦缺血再灌注損傷后，大鼠出現神經功能缺損、梗死灶等表現，與模型組比較，丹皮酚預處理組，大鼠腦梗死灶縮小、神經功能缺損有所改善，說明丹皮酚起到了腦神經的保護作用。實驗進一步證實了腦缺血再灌注損傷后，腦缺血再灌注海馬細胞周圍TUNEL陽性細胞數和Bcl-2、Bax、Hsp-70蛋白表達發生了變化，說明細胞凋亡機制參與了腦缺血再灌注損傷，與模型組比較，丹皮酚預處理組，TUNEL陽性細胞數和Bax蛋白的表達減少，而Bcl-2和Hsp-70蛋白的表達增加，說明丹皮酚能有效上調Hsp-70、Bcl-2蛋白表達，下調Bax蛋白表達，抑制神經細胞凋亡，減輕腦組織損傷。這為缺血性腦卒中的二級預防治療，頸動脈狹窄解除、顱腦損傷、顱內占位切除等術前治療后的預后改善提供了新的途徑，也為臨床上缺血性腦卒中的治療提供了一定的參考。

綜上所述，在腦缺血再灌注損傷前給予丹皮酚預處理能有效改善腦組織損傷，其機制可能與上調Hsp-70、Bcl-2蛋白表達，下調Bax蛋白表達，減輕腦缺血再灌注損傷后的神經細胞凋亡有關。除此之外，丹皮酚是否通過其他途徑對損傷的腦神經起到一定的保護作用，還需進一步深入研究。